Với các ưu điểm về khả năng tận dụng ánh sáng, tiết kiệm diện tích khai thác, hạn chế nhiễm tạp, có thể quản lý quá trình nuôi trồng tốt và ngày càng được hoàn thiện về kỹ thuật cũng như sự thay thế của các vật liệu kinh tế hơn, nuôi trồng vi tảo trong các hệ thống kín đang ngày càng được quan tâm phát triển. Đặc biệt với các loài vi tảo có giá trị kinh tế cao như Nannochloropsis, Haematococcus,… Trong nuôi trồng loài vi tảo lục Haematococcus hiện nay, chưa một mô hình nào nuôi thành công ở bể hở cho giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy hai pha cho hiệu quả kinh tế được công bố. Mặt khác, các mô hình nuôi trồng loài vi tảo này ở quy mô thương mại hiện nay vẫn đang phát triển nuôi giai đoạn đầu ở trong hệ thống kín 8000 – 25000 lít trước khi cho ra bể hở để thực hiện quá trình chuyển giai đoạn sang tích lũy astaxanthin (Li và cs., 2011; Olaizola, 2000). Từ trước đến nay, các quan điểm cho rằng, nuôi trồng vi tảo trong các hệ thống kín có nhiều ưu điểm nhưng mắc phải nhược điểm lớn nhất là chi phí cao dẫn đến giá thành sản phẩm cao và khó cạnh tranh. Với đánh giá gần đây cho thấy, nuôi trồng vi tảo trong các hệ thống này có khả năng giảm chi phí
đáng kể (Li và cs., 2011) cùng với sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật tìm kiếm các nguồn vật liệu thay thế có chi phí thấp hơn. Điều này đã một lần nữa khẳng định vai trò và khả năng ứng dụng các mô hình này trong nuôi trồng vi tảo trong tương laị
Ở Việt Nam hiện nay, nghiên cứu nuôi trồng vi tảo trong hệ thống kín cũng đã và đang được thực hiện. Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học đã nuôi trồng một số loài vi tảo biển thành công trong hệ thống kín dạng ống ở quy mô 10 – 20 lít trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vi tảo biển làm nguyên liệu sản xuất diezen sinh học” do TS. Đinh Thị Thu Hằng làm chủ nhiệm. Đề tài thuộc Chương trình Đề tài/Dự án Phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 tầm nhìn 2025 do Bộ Công thương quản lý. Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II cũng đang triển khai đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi thâm canh và thu sinh khối vi tảo Isochrysis galbana và
Nannochloropsis oculata phục vụ sản xuất giống hải sản” do TS. Đặng Tố Vân
Cầm làm chủ nhiệm. Đề tài thuộc chương trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp Thủy sản, lựa chọn mô hình nuôi cấy hai loài vi tảo biển trên trong hệ thống kín dạng ống dẫn và vành khuyên (Viện nghiên cứu thủy sản II). Đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi trồng vi tảo Haematococcus pluvialis và công nghệ chiết xuất astaxanthin” do ThS. Ngô Thị Hoài Thu làm chủ nhiệm, thuộc chương trình Đề án phát triển Công nghệ sinh học trong nuôi trồng thủy sản do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý 2010-2012 cũng đang được phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học tiến hành. Đề tài cũng hướng tới nuôi trồng loài vi tảo lục H. pluvialis trong hệ thống photobioreactor kín dạng ống. Nhằm tham gia giải quyết một trong những nội dung nghiên cứu của đề tài nêu trên, chúng tôi tiến hành một hướng nghiên cứu nhỏ với tên đề tài là “Tối ưu điều kiện nuôi loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong hệ thống photobioreactor kín ở quy mô dung tích 20 lít”. Mục tiêu của đề tài là đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất vi tảo H. pluvialis trong hệ thống kín 20 lít để có được những cơ sở khoa học để phát triển quy mô nuôi trồng loài vi tảo này thành công trong hệ thống photobioreactor kín nàỵ
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu
Loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow dùng trong nghiên cứu được cung cấp từ tập đoàn giống của phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học.
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của phòng Công nghệ Tảo trong thời gian từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 9 năm 2012.
2.2. Chuẩn bị giống ban đầu cho nuôi trong hệ thống kín
Loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow dùng trong nghiên cứu do phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học phân lập tại Hòa Bình và Lào Caị Giống ban đầu được nuôi tĩnh trong môi trường C trong bình tam giác 1000 mL, đến mật độ 0,5 x 106 tế bào/mL được cấy chuyển sang bình 1,5 lít hàng ngày bổ sung môi trường mới đến khi đạt thể tích 1 lít. Sau đó, giống tiếp tục được cấy chuyển sang bình nhựa 10 lít, nuôi liên tục bằng cách bổ sung môi trường mới hàng ngày, đến khi đạt thể tích 5 lít và đảm bảo sạch, không lẫn các loài tảo khác được làm giống ban đầu cho thí nghiệm hệ thống kín 20 lít. Môi trường nuôi cấy trong hệ thống photobioreactor kín là RM hoặc RM-4X tùy thuộc từng thí nghiệm (Đặng Diễm Hồng và cs., 2012).
Hệ thống kín 20 lít dùng trong thí nghiệm do phòng Công nghệ Tảo thiết kế gồm ba dãy ống acrylic xếp song song ở hai phía, nối với nhau bằng đoạn ống nhựa PVC trong suốt có đường kính 5 cm, dung tích 10 lít nối với một bình chứa 20 lít và tích hợp với máy bơm tuần hoàn, có hệ thống sục khí.
Hệ thống kín được rửa sạch bằng nước máy và khử trùng bằng dung dịch Javen 0,5%, sau đó rửa sạch nhiều lần để loại hết Javen và chuẩn bị vào môi trường.
Các thí nghiệm tiến hành trong hệ thống kín 20 lít được nuôi với thể tích dịch tảo 24 lít, mật độ ban đầu đạt khoảng 0,06 – 0,07 x 106 tế bào/mL (giá trị OD680 tương ứng ≈ 0,015), được chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, cường độ ánh sáng 2500 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng: tối là 12:12 giờ. Tất cả các lần chạy hệ thống kín sau khi chạy ổn định 20-30 phút, rút ra 3 lít dịch tảo sang bình nhựa 10 lít nuôi trong cùng điều kiện làm đối chứng.
2.3. Tối ưu các điều kiện nuôi trồng H. pluvialis trong hệ thống kín 20 lít
2.3.1. Đánh giá sinh trưởng của tảo H. pluvialis trong hệ thống kín 20 lít
Thí nghiệm được tiến hành với mật độ ban đầu là 0,06 –0,07 x 106 tế bào/mL, sử dụng môi trường RM, không bổ sung môi trường hàng ngàỵ Thể tích làm việc của hệ thống kín là 20 lít, sinh trưởng của tảo trong hệ thống kín được so sánh với hệ thống hở trong cùng điều kiện.
2.3.2. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí bề mặt lên tính bám của tảo H. pluvialis
Giống tảo ban đầu được nuôi với mật độ 0,15 x 106 tế bào/mL với thể tích ban đầu 16 lít, hàng ngày bổ sung 1 lít môi trường RM-4X trong đó, tốc độ sục khí bề mặt thay đổi tương ứng là: 25; 35; 45 và 55 ± 3 cm/s.
2.3.3. Ảnh hưởng của mật độ ban đầu và chế độ bổ sung môi trường lên sinh trưởng và trạng thái tế bào của H. pluvialis trong hệ thống kín 20 lít
Thí nghiệm được tiến hành với mật độ ban đầu 0,10 – 0,15; 0,30 và 0,50 x 106 tế bào/mL, thể tích vận hành hệ thống kín ban đầu là 16 lít, hàng ngày bổ sung thêm 1; 2 lít môi trường RM và RM-4X hoặc 10RM-4X cho đến khi đạt thể tích tối đa là 26 lít. Sau đó, tiến hành perfusion theo phương pháp của Lee và Palsson (1995) có một số cải tiến phù hợp với từng điều kiện nuôi theo cách: lấy ra một lượng dịch tảo, để lắng, loại môi trường và bổ sung thêm một lượng môi trường mớị Trong đó, có bổ sung Nanno Aqua (NA) 3 ngày 1 lần tương ứng với thể tích vận hành theo tỷ lệ 1 mL NA cho 1 lít dịch nuôị
Trong đó, môi trường 10RM-4X là môi trường RM-4X có hàm lượng các chất cao gấp 10 lần- riêng hàm lượng NO3- trong môi trường này cao gấp 40 lần môi trường RM thông thường, tương ứng.
Cách pha stock NA:
STT Hóa chất Lượng cân (g)
1 Nano Aqua 0,25
2 Nấm men 0,2
3 Phân Urea 0,4
4 Phân supe lân 0,08
5 Phân giun quế 12,5
6 Nước cất 100 mL
Trong đó: Nano Aqua bao gồm các chất dinh dưỡng vi mô ở dạng Nanọ Nó có thành phần chính là silica, sắt, magie, coban, bo, canxi, kẽm, mangan, molypden…do FOB của Ấn Độ cung cấp (có gía 10,98 đô la/kg); phân giun quế và lân được pha trong 100 mL nước cất, ngâm chiết qua đêm, ly tâm ở 3500 vòng/phút trong 10 phút, lọc qua giấy lọc sau đó thêm phân urea, nấm men (loại để làm bánh mỳ) và Nano Aqua, định mức lên 100 mL, khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Stock này được giữ ở nhiệt độ 100C.
2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của tảo H. pluvialis
Thí nghiệm được tiến hành ở hai ngưỡng nhiệt độ 33-35 0C và 27-29 0C, tương ứng với nhiệt độ trung bình là 34 và 28 0C với mật độ ban đầu là 0,3 x 106 tế bào/mL, thể tích giống ban đầu là 16 lít. Trong ba ngày đầu, mỗi ngày bổ sung 1 lít môi trường RM-4X, còn các ngày tiếp theo, mỗi ngày bổ sung thêm 2 lít môi trường RM-4X đến khi thể tích dịch nuôi đạt 26 lít thì tiến hành perfusion như đã trình bày ở phần 2.3.3.
2.3.5. Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng lên sinh trưởng của loài vi tảo H. pluvialis trong hệ thống kín 20 lít pluvialis trong hệ thống kín 20 lít
Thí nghiệm được tiến hành với mật độ ban đầu 0,30 – 0,50 x 106 tế bào/mL ở điều kiện chiếu sáng ánh sáng trắng kết hợp với chiếu UV với chu kỳ sáng: tối 16:8 giờ trong đó thời gian chiếu ánh sáng trắng là 10 giờ và thời gian chiếu ánh sáng trắng kết hợp UV là 6 giờ (Đặng Diễm Hồng và cs., 2012) ở nhiệt độ 27 – 29 0C với phương thức bổ sung môi trường như đã trình bày trong phần 2.3.4, công thức đối chứng được chiếu sáng bằng ánh sáng trắng, chu kỳ sáng: tối là 12:12 giờ.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp xác định sinh trưởng của tảo
- Xác định mật độ tế bào vi tảo bằng buồng đếm Burker – Turk (Đức): Lắc đều mẫu, dùng pippete man trộn đều mẫu cần đếm, pha loãng mẫu 5 – 20 lần tùy theo số lượng tế bào và nhỏ một lượng cần thiết (40 µL) chia đều vào mỗi buồng đếm, đậy la men sao cho la men không lệch ra khỏi buồng đếm, đặt la men nghiêng 45º so với buồng đếm rồi đặt xuống từ từ để tránh tạo ra bọt khí, đợi trong 5 phút sau đó đặt buồng đếm lên kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Nhật Bản).
Điều chỉnh tiêu cự của kính hiển vi quang học và tiến hành quan sát ở vật kính 10X để tìm được buồng đếm trên thị trường, điều chỉnh ốc vi cấp để quan sát tế bào rõ hơn. Tiến hành đếm trên cả 16 ô lớn của buồng đếm. Cần chú ý khi đếm phải qui ước cạnh được đếm trên ô vuông lớn để đếm chính xác hơn. Số lần đếm được lặp lại khoảng 5 đến 6 lần.
Mật độ tế bào được tính theo công thức: D = A * X * 104
Trong đó, D: Mật độ tế bào (tế bào/mL); A: Tổng số tế bào trong 16 ô của buồng đếm; X: Hệ số pha loãng.
- Tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ), được tính theo công thức (Molina và cs., 2001)
µ = (lnN2 –lnN1)/(t2 – t1)
Trong đó, N1, N2 : mật độ tế bào (tế bào/mL) ở ngày thứ t1 và t2.
- Đo mật độ quang học ở bước sóng 680 nm (OD680): Mật độ tế bào tảo H. pluvialis trong môi trường nuôi có thể được xác định một cách gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 680 nm trên máy quang phổ OD UV 1601 (Nhật Bản). Theo phương pháp này, số lượng photon ánh sáng bị hấp thụ tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào trong mẫu đem đo (trừ những mẫu có nồng độ tế bào quá đậm đặc), hay nói cách khác là trong những điều kiện sinh trưởng nhất định thì OD tỉ lệ thuận với mật độ tế bàọ Trong quá trình đo, nếu giá trị OD > 1,0 thì cần pha loãng dịch tảo sao cho OD luôn nhỏ hơn 1,0.
- Xác định khối lượng sinh khối tảo: Ở các thời điểm thu mẫu, 700 mL dịch nuôi được ly tâm thu sinh khối tế bào, chuyển vào đĩa petri đường kính 5 cm đã biết khối lượng, cân được khối lượng sinh khối tươi (SKT). Sau đó, sinh khối được sấy ở 60 0C trong 3 giờ và cân lại để xác định khối lượng sinh khối khô (SKK). Các phép cân được tiến hành bằng cân kỹ thuật (Precisa XT2200A, Thụy Điển). Sinh khối này tiếp tục được sử dụng để xác định hàm lượng lipid.
Khối lượng sinh khối của mẫu được xác định theo công thức sau: KL (SKT, SKK) (g) = KL (cốc+sinh khối tảo) - KL (cốc)
Năng suất sinh khối được xác định là gSKT/L, gSKT/L/ngày và gSKT/m2/ngàỵ
2.4.2. Tách chiết lipid
Tách chiết lipid từ sinh khối vi tảo được tiến hành theo phương pháp Bligh và Dyer (1959) có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam. Sinh khối tảo khô được cân trọng lượng và nghiền mịn trong cối chày sứ với 0,5 gam Na2SO4 và cát thủy tinh. Lipid tổng số được tách chiết từ
khối được chiết tiếp với chloroform 2–3 lần để thu tối đa lipid chứa trong sinh khối tảọ Dịch chiết được trộn đều với nhau, lọc qua giấy lọc Whatman Nọ1 và chuyển sang phễu chiết. Bổ sung thêm 15 mL dung dịch NaCl 0,9%, trộn đều và để yên ở nhiệt độ phòng qua đêm. Hỗn hợp phân tách thành 2 lớp, lớp hữu cơ phía dưới chứa các thành phần lipid được thu nhận và chuyển sang cốc thủy tinh đã cân trọng lượng. Lớp methanol - nước phía trên được rửa 2 lần với chloroform và thu lấy lớp dưới theo cách tương tự như trên. Dung môi được loại bỏ hoàn toàn trong bể ổn nhiệt ở 60 0C và làm khô trong desiccator. Cốc thủy tinh chứa lipid thô được cân trọng lượng. Lượng lipid thu được là sự chênh lệch về trọng lượng của cốc thủy tinh ban đầu và trọng lượng của cốc thủy tinh chứa lipid. Hàm lượng lipid tổng số được tính bằng số gam lipid thu được trên số gam tảo khô.
2.4.3. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red (Doan và Obbard, 2011)
Nhuộm tế bào tảo bằng Nile Red (9-(Diethylamino)-5H benzo [α] phenoxazin-5-one) nhằm mục đích phát hiện các hạt lipid trong tế bào tảọ 3 mL dịch nuôi tảo có mật độ 0,4 x 106 tế bào/mL được bổ sung thêm glycerol tinh khiết để đạt nồng độ cuối cùng của glycerol là 0,1 g/mL. Sau đó, 5 µL dung dịch Nile Red nồng độ 0,25 mg/mL trong aceton được bổ sung vào dịch tảọ Hỗn hợp được voltex nhẹ nhàng và ủ tối trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào tảo đã được nhuộm Nile Red được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (NIKON eclipse 80i-Nhật Bản) với ánh sáng kích thích có bước sóng 450–490 nm và ánh sáng phát huỳnh quang của Nile Red có bước sóng 540-640 nm.
2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng các sắc tố
Hàm lượng các sắc tố được xác định theo phương pháp của Strickland và Person (1977). Sinh khối tảo được nghiền với cát thủy tinh và bổ sung 10 mL acetonẹ Sau đó lọc mẫu, định mức bằng acetone lên 10 mL, phần dịch trong được đo ở các bước sóng: 665; 645; 630 và 480 nm; hàm lượng các sắc tố được xác định theo công thức:
C (Chl a) = 11,6 x E665 – 1,31 x E645 – 0,14 x E630 C (Chl b) = 20,7 x E645 – 4,34 x E665 – 4,42 x E630
C (Carotenoit tổng số) = 4,0 x E480
Trong đó: V là lượng thể tích dịch tảo đem lọc (L) Ci: là giá trị OD đo được ở bước sóng i
(Đối với Haematococcus, nhiều công trình công bố cho thấy, hàm lượng carotenoit tổng số của tế bào chủ yếu là astaxanthin hấp thụ cực đại ở bước sóng 480 nm. Do vậy, hàm lượng carotenoit ở loài tảo này được xem chính là hàm lượng của astaxanthin).
2.4.5. Phương pháp xác định hàm lượng protein nội bào
Tách chiết protein
Lọc 5 mL dịch tảo bằng giấy lọc GF/C, cho vào lọ penicillin, cất trong ngăn