3.3.1. Ảnh hưởng của pH và vật liệu bình chứa
Chuẩn bị 7 dung dịch đệm có pH cố định (dung dịch đệm), các dung dịch này đƣợc pha chế bằng hóa chất tinh khiết loại PA của Merck, dùng nƣớc cất 2 lần đã đề ion và sục N2 trong 20 phút để đuổi oxi hòa tan. Chuẩn bị 7 dung dịch chứa 4
dạng Se (Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMt) có nồng độ 4 dạng tƣơng ứng là Se(IV) 25ppb, Se(VI) 25ppb, DMDSe 15ppb, SeMt 15ppb; mỗi dung dịch đƣợc định mức bằng một dung dịch có pH đã chuẩn bị ở trên, đậy kín miệng bình và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong suốt quá trình khảo sát. Tất cả các dung dịch khác cũng đƣợc đậy kín tránh oxi xâm nhập, đựng trong lọ thủy tinh bảo quản với điều kiện tƣơng tự.
Sau khoảng 8h, 5ml mỗi dung dịch đƣợc lấy ra cho vào bình định mức 25ml, định mức bằng dung dịch HCl có pH=2, tiếp theo thực hiện phép đo phổ AAS của Se ở 5 môi trƣờng khử HCl 6M, HCl 4M, HCl 2M, HCl 1M và HCl pH = 2, với các điều kiện đo và phản ứng tạo hiđrua hóa đã khảo sát ở mục 3.1.1. Độ hấp thụ quang (ABS) đo đƣợc nhập vào mô hình tính toán đã khảo lập đƣợc ở mục 3.2.1. Kết quả tính thể hiện qua bảng 3.8.
Bảng 3.8: Sự ảnh hƣởng của pH đến sự chuyển dạng của Selen
pH Kết quả xác định dạng Se Kết quả xác định tổng Se Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng ppb % Thu hồi Se tổng % Thu hồi 1 4,92 4,74 3,02 2,96 15,64 97,75 15,89 99,31 2 4,92 4,73 2,98 2,96 15,59 97,44 15,88 99,25 3 4,91 4,63 2,97 2,96 15,47 96,68 15,87 99,20 5 4,84 4,60 2,89 2,95 15,28 95,50 15,26 95,38 8 4,63 4,58 2,85 2,90 14,96 93,50 14,88 93,00 10 4,60 4,54 2,79 2,87 14,80 92,52 14,83 92,69 12 4,58 4,50 2,75 2,87 14,70 91,90 14,69 91,81
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hƣởng của pH tới quá trình chuyển dạng của Selen
Kết quả từ đồ thị hình 3.1 cho thấy, ở pH ≤ 2 nồng độ các dạng Se tìm thấy không sai khác nhiều so với lƣợng cho vào. Ở pH = 3 lƣợng Se (IV) thay đổi khá nhiều so với lƣợng cho vào, khi pH ≥ 5 thì sự thay đổi rõ rệt ở tất cả các dạng Se, hàm lƣợng các dạng Se tìm thấy đều có xu hƣớng giảm. Tổng hàm lƣợng Se tìm thấy có hiệu suất thu hồi giảm đáng kể. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi này, trong đó có khả năng ảnh hƣởng của vật liệu bình chứa, bởi vì các bình chứa đều là thủy tinh (thành phần chính là SiO2, dễ thủy phân tạo ra Si(OH)x). Để kiểm tra sự hấp thụ của bình chứa, chúng tôi cho dung dịch ở bình định mức vào cốc teflon và bảo quản ở các điều kiện nhƣ trên, tiến hành thí nghiệm nhƣ qui trình khảo sát trên, kết quả thể hiện qua bảng 3.9:
Bảng 3.9: Sự hấp thụ các dạng Se của vật liệu teflon pH Kết quả xác định dạng Kết quả xác định tổng Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng ppb % thu hồi Tổng Se % thu hồi 3 4,92 4,88 2,97 2,83 15,60 97,50 15,89 99,31 5 4,92 4,86 2,95 2,82 15,55 97,19 15,87 99,19 8 4,89 4,89 2,96 2,83 15,57 97,31 15,86 99,13 10 4,89 4,85 2,95 2,79 15,48 96,75 15,79 98,69
Dựa vào kết quả ở bảng 3.9, cho thấy hiệu suất thu hồi tổng dạng Se khá cao (trên 96%), phép phân tích tổng Se cũng cho thấy hiệu suất thu hồi gần nhƣ 100%, điều đó có thể khẳng định vật liệu bình làm bằng teflon không hấp thụ các dạng Se, hàm lƣợng các dạng Se không thay đổi nhiều so với thành phần lúc ban đầu. Kết quả này cũng cho nhận định là các dạng Se có trong dung dịch khảo sát không bị chuyển dạng khi pH của dung dịch thay đổi trong thời gian khảo sát là 8h, thời gian lâu hơn thì chúng tôi sẽ khảo sát ở các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Ảnh hưởng của oxi
Chúng tôi tiến hành cố định pH của các dung dịch chứa các dạng Se có thành phần và hàm lƣợng các dạng Se vẫn nhƣ thí nghiệm ở mục 3.3.1. Hai thí nghiệm đƣợc tiến hành song song, thí nghiệm thứ nhất chúng tôi tiến hành để miệng bình hở trong môi trƣờng không khí để oxi xâm nhập, thí nghiệm thứ hai tiến hành đồng thời nhƣng các dung dịch dùng kể cả nƣớc cất cũng đƣợc đuổi oxi bằng cách sục khí nitơ và đậy nắp rồi băng kín lại. Tất cả các điều kiện khác đƣợc đảm bảo giống nhƣ mục 3.3.1. Kết quả đo phổ thể hiện qua các bảng 3.10:
Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của oxi có trong dung dịch đến sự chuyển dạng Se Thời
gian Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb
Tổng dạng ppb 2h 4,93 98,60% 4,78 95,60% 3,02 100,7% 2,97 90,03% 19,55 98,13% 4h 4,91 98,20% 4,83 96,60% 3,02 100,7% 2,97 98,93% 19,67 98,31% 6h 4,72 94,40% 5,02 100,4% 2,97 99,00% 2,64 87,90% 117,2 95,94% 8h 4,42 88,40% 5,21 104,2% 2,89 96,30% 2,28 75,93% 18,45 92,50% 12h 3,98 79,60% 5,58 111,6% 2,87 95,67% 2,01 67,03% 17,98 90,25% 24h 2,74 54,80% 6,07 121,4% 2,67 89,00% 1,99 62,27% 16,74 84,19% 48h 1.98 39.60% 6,83 136,6% 2,58 86,00% 1,21 40,20% 15,62 78,75%
Hình 3.2: Sự chuyển dạng Se khi có mặt của oxi
Theo hình 3.2, sau 4h các dạng Se bắt đầu chuyển hóa lẫn nhau. Dạng Se (IV) vô cơ và các dạng hữu cơ (DMDSe, SeMt) có xu hƣớng chuyển sang dạng Se (VI) vô cơ vì các đƣờng biểu diễn của chúng đi xuống trong khi đƣờng biểu diễn của Se (VI) lại đi lên. Dạng DMDSe hầu nhƣ không chuyển hóa, dạng SeMt sau 8h thì chuyển hóa mạnh do đƣờng biểu diễn dốc hơn, dạng Se(IV) chuyển hóa rõ rệt
nhất, đây là dạng chuyển sang dạng Se(VI) vô cơ chủ yếu. Nói tóm lại, khi có mặt oxi sẽ xảy ra các phản ứng oxi hóa làm các dạng Se(IV) vô cơ chuyển hóa thành dạng Se(VI) vô cơ. Để khẳng định điều này, chúng tôi so sánh với kết quả khảo sát trong thí nghiệm có đuổi oxi trong bảng 3.11:
Bảng 3.11: Sự chuyển dạng Se khi không có oxi
Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng
2h 4,98 99,60% 4,88 97,60% 3,01 100,3% 2,98 99,33% 15,85 99,16% 4h 4,98 99,60% 4,89 97,80% 2,99 99,67% 2,98 99,33% 15,84 99,00% 6h 4.90 98,00% 4,90 98,00% 2,99 99,67% 2,97 99,00% 15,76 98,50% 8h 4,79 95,80% 4,97 99,40% 2,89 96,33% 2,95 98,33% 15,60 97,50% 12h 4,79 95,80% 5,00 100,0% 2,87 95,67% 2,88 96,00% 15,54 97,13% 24h 4,67 93,40% 5,11 102,2% 2,81 93,67% 2,80 93,33% 15,39 96,19% 48h 4,50 90,00% 5,26 105,2% 2,72 90,67% 2,70 90,00% 15,18 94,88%
Nhìn vào hình 3.3, cho thấy sau 8h các đƣờng biểu diễn nồng độ các dạng Se mới có xu hƣớng lệch đáng kể, ở bảng trên cũng cho thấy sau 1 ngày (24h) thì hàm lƣợng các dạng tìm thấy đều lớn hơn 90%, sang ngày thứ 2 thì lƣợng tìm thấy của các dạng này vẫn ở ngƣỡng 90%, tuy nhiên nếu nhìn vào hình biểu diễn thì có sự khác biệt rõ rệt sau 24h bảo quản trong môi trƣờng khí trơ nitơ, chủ yếu vẫn là sự chuyển dạng Se(IV) vô cơ thành Se(VI) vô cơ. Chúng tôi chọn thời gian bảo quản cho mẫu tối đa là 24h để làm các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.3. Ảnh hưởng của ion Fe3+ và cách loại trừ
Trong mẫu thủy-hải sản thƣờng có nhiều các ion kim loại nhƣ Fe, Cu, Hg, Zn… khi tiến hành tách chiết các dạng hợp chất của Se thì chúng cũng đƣợc tách chiết cùng, sự có mặt của chúng không ảnh hƣởng đến kết quả xác định tổng hàm lƣợng Se hoặc kết quả phân tích dạng vì vạch phổ hấp thụ của chúng khá xa vạch phổ hấp thụ của Se nếu nhƣ mẫu đƣợc phân tích ngay sau khi xử lý. Tuy nhiên thì ion Fe3+ khi có mặt trong dung dịch là một tác nhân có tính oxi hóa sẽ làm chuyển hóa các hợp chất trong mẫu, tức là khi có mặt ion Fe3+ sẽ khó khăn cho quá trình bảo quản mẫu phân tích.
Chúng tôi làm các thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của ion Fe3+ đến sự tồn tại của 4 dạng Se. Các thí nghiệm này đƣợc tiến hành nhƣ sau: các dung dịch Se đƣợc chuẩn bị có nồng độ nhƣ mục 3.3.1, pH của dung dịch đƣợc cố định bằng dung dịch đệm có pH=1, ion Fe3+
đƣợc thêm vào các dung dịch đó với lƣợng thay đổi để các dung dịch sau cùng có hàm lƣợng Fe3+ từ 10–300 ppb, các dung dịch đƣợc bảo quản với các điều kiện nhƣ mục 3.3.1, sau 8h thì thực hiện quy trình xác định dạng Se nhƣ đã mô tả ở mục 3.3.1. Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy khi nồng độ ion Fe3+
trong dung dịch ở mức ≥ 50ppb thì hiệu suất thu hồi các dạng cho thấy chúng thay đổi khá nhiều, 3 dạng Se(IV), DMDSe, SeMt có hiệu suất thu hồi âm, riêng Se(VI) hiệu suất thu hồi dƣơng, tổng dạng Selen thì có hiệu suất thu hồi rất tốt và coi nhƣ không thay đổi. Từ đó, chúng tôi nhận định 3 dạng Se(IV), DMDSe, SeMt chuyển hóa một phần thành Se(VI) chứ không chuyển hóa thành dạng khác, các dạng Se không bị mất ở khoảng nồng độ Fe3+ khảo sát. Khi nồng độ ion Fe3+≥ 150ppb có sự chuyển
hóa mạnh các dạng Se(IV) và SeMt sang Se(VI), điều này chúng tôi lý giải lúc này phản ứng oxi hóa Se(IV), SeMt xảy ra mạnh khi nồng độ Fe3+ tăng cao.
Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của ion Fe3+
đến quá trình chuyển dạng Se Fe3+
ppb Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb
Tổng dạng ppb 10 5,02 100,4% 4,86 97,2% 3,00 100,0% 2,91 97,0% 15,79 98,7% 20 5,06 101,2% 4,91 98,2% 2,93 97,7% 3,04 101,3% 15,94 99,6% 30 4,93 98,6% 5,29 105,8% 2,84 94,7% 2,88 96,0% 15,94 99,6% 50 4,85 97,0% 5,68 113,6% 2,81 93,7% 2,74 91,3% 16,08 100,5% 100 4,62 92,4% 5,95 119,0% 2,79 93,0% 2,63 87,7% 15,99 99,9% 150 4,01 80,2% 6,18 123,6% 2,72 90,7% 2,52 84,0% 15,43 96,4% 200 3,28 65,6% 6,40 128,0% 2,66 88,7% 2,19 73,0% 14,53 90,8% 300 2,69 53,8% 6,79 135,8% 2,57 85,7% 1,77 59,0% 13,82 86,4%
Để có cái nhìn rõ ràng hơn về ảnh hƣởng của ion Fe3+
và chỉ rõ khoảng nồng độ ảnh hƣởng, chúng tôi biễu diễn kết quả ở đồ thị hình 3.4, nhìn vào hình 3.4 cho thấy đƣờng biểu điễn của Se(IV) khá dốc xuống, SeMt thì ít dốc hơn, còn Se(VI) dốc lên. Nhƣ vậy có thể nói phản ứng chuyển dạng chủ yếu ở đây vẫn là từ Se(IV) thành Se(VI), điểm bắt đầu gãy nhìn rõ là hàm lƣợng Fe3+ = 50ppb.
3+
C Fe3+(ppb) CSe(ppb)
Nhƣ vậy, sự có mặt của ion Fe3+
sẽ làm chuyển hóa các dạng Se trong mẫu ở ngay nồng độ nhỏ 50ppb. Theo một số tài liệu, giảm bớt ảnh hƣởng của ion Fe3+ có thể dùng EDTA, vai trò EDTA là tạo phức với Fe3+ làm ngăn cản phản ứng oxi hóa. Để khảo sát khả năng dùng EDTA làm giảm ảnh hƣởng của Fe3+
, chúng tôi dùng các dung dịch Se đƣợc tạo ra nhƣ mục 3.3.1, lƣợng Fe3+ đƣợc thêm vào cố định để dung dịch cuối cùng chứa 150ppb Fe3+, hàm lƣợng EDTA thêm vào các dung dịch thay đổi sao cho ở mỗi dung dịch có nồng độ tƣơng ứng nhƣ bảng 3.12. Các dung dịch sau cùng đƣợc bảo quản nhƣ ở mục 3.3.1, sau 8h các dạng Se đƣợc xác định theo qui trình nhƣ mục 3.3.1:
Bảng 3.13: Khả năng loại trừ ảnh hƣởng của Fe3+ bằng EDTA EDTA (mol/lít) Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng ppb 0,01 4,06 81,20% 6,22 124,4% 2,66 88,70% 2,57 85,7% 15,51 96,9% 0,05 4,09 81,80% 6,04 120,8% 2,73 91,00% 2,61 87,0% 15,47 96,7% 0,10 4,15 83,00% 5,85 117,0% 2,84 94,70% 2,75 91,7% 15,59 97,4% 0,15 4,27 85,40% 5,61 112,2% 2,91 97,00% 2.81 93,7% 15,60 97,5% 0,20 4,83 96,60% 5,03 100,6% 2,96 98,70% 2,87 95,7% 15,69 98,1% 0,25 5,04 100,8% 4,95 99,00% 2,94 98,00% 2,88 96,0% 15,81 98,8% 0,30 5,07 101,4% 4,97 99,40% 2,88 96,00% 2,91 97,0% 15,83 98,9% 0.50 5,12 102,4% 4,89 97,80% 2,93 97,70% 2,86 95,3% 15,80 98,8% 1.00 5,18 103,6% 4,82 96,40% 3,04 101,0% 2,99 99,7% 16,03 100,0%
Theo kết quả tính hiệu suất thu hồi ở bảng 3.13, cho thấy các dạng Se(IV), DMDSe, SeMt đều tăng còn Se(VI) giảm xuống, trái ngƣợc lại so với thí nghiệm chỉ thêm Fe3+ mà không thêm EDTA. Điều này có thể kết luận EDTA làm giảm khả năng chuyển hóa dạng Se khi có mặt của ion Fe3+, nhƣ vậy trong quá trình bảo quản mẫu nên cho EDTA để giảm khả năng ảnh hƣởng của Fe3+. Theo kết quả biểu diễn trên hình 3.5, đƣờng biểu diễn của Se(VI) đi xuống, đƣờng biểu diễn Se(IV) đi lên và giao nhau ở điểm nồng độ EDTA là 0,2M, các đƣờng biểu diễn DMDSe, SeMt cũng có xu hƣớng đi lên, các đƣờng này thay đổi không đáng kể khi EDTA ≥ 0,2M.
Nhƣ vậy có thể khẳng định quá trình chuyển dạng chính khi có mặt của Fe3+ là từ Se (IV) thành Se (VI), khi thêm EDTA vào thì quá trình này hầu nhƣ không diễn ra nữa. Chúng tôi chọn lƣợng EDTA cho vào các dung dịch để bảo quản có nồng độ cuối cùng là 0,2M.
Hình 3.5: Đánh giá khả năng loại trừ ảnh hƣởng của Fe3+ bởi EDTA 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng các yếu tố đi kèm trong nền mẫu thực phẩm
3.4.1. Ảnh hưởng của chất béo stearin và cách loại trừ.
Trong quá trình chiết tách các hợp chất của Se trong mẫu bằng dung môi hữu cơ Metanol/H2O, các hợp chất hữu cơ nhƣ chất béo và protein sẽ đƣợc chiết tách cùng. Sự có mặt của chúng trong dung dịch sẽ ảnh hƣởng phần nào đến tín hiệu đo và đến kết quả phân tích các dạng Se. Để đánh giá ảnh hƣởng của chúng, chúng tôi chuẩn bị các dung dịch chứa đồng thời 4 dạng Se với nồng độ Se(IV) 5ppb, Se(VI) 5ppb, DMDSe 3ppb, SeMt 3ppb, sau đó thêm vào các lƣợng stearin khác nhau, dung dịch đƣợc định mức bằng dung dịch HCl pH=2. Các dung dịch thu đƣợc đem xác định ngay nồng độ các dạng Se theo qui trình ở mục 3.3.1.
Chúng tôi xử lý kết quả phân tích và đƣa ra ở bảng 3.14. Hiệu suất thu hồi của mỗi dạng Se đƣợc tính bằng % lƣợng Se tìm thấy so với lƣợng Se cho vào. Tổng dạng Se trong dung dịch bằng tổng các dạng tìm thấy, hiệu suất tổng dạng Se
CSe(ppb)
cũng đƣợc tính bằng % tổng dạng Se tìm thấy so với tổng dạng Se cho vào. Các kết quả tính hiệu suất thu hồi đƣợc chúng tôi biểu diễn trên bảng 3.14.
Bảng 3.14: Kết quả tính nồng độ và hiệu suất thu hồi các dạng Se trong dung dịch khi có chất béo Stearin ppb Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng Se ppb 10 5,02 100,40% 4,83 96,60% 2,87 95,67% 2,95 98,33% 15,67 97,94% 20 5,05 101,00% 4,87 97,40% 2,74 91,33% 2,84 94,67% 15,50 96,88% 50 4,97 99,40% 4,99 99,80% 2,66 88,67% 2,77 92,33% 15,39 96,19% 100 4,86 97,20% 5,01 100,20% 2,58 86,00% 2,62 87,33% 15,07 94,19% 150 4,42 88,40% 4,86 97,20% 2,03 67,67% 2,19 73,00% 13,50 84,38% 200 4,07 81,40% 4,35 87,00% 1,41 47,00% 1,73 57,67% 11,56 72,25% 250 3,84 76,80% 4,21 84,20% 1,02 34,00% 1,38 46,00% 10,45 65,31% 300 3,41 68,20% 3,69 73,80% 0,35 11,67% 1,06 35,33% 8,51 53,19%
Theo hình 3.6, tất cả các đƣờng biểu diễn hiệu xuất thu hồi các dạng Se và tổng dạng Se đều có xu hƣớng đi xuống, đƣờng biểu diễn dạng DMDSe và SeMt là dốc nhất. Căn cứ vào hình 3.6, có thể kết luận khi hàm lƣợng chất béo trong mẫu ≥100ppb thì độ thu hồi của DMDSe, SeMt giảm xuống dƣới 80%. Điều này chúng tôi giải thích là do các dạng selen hữu cơ này có chứa gốc hiđrocacbon nên chúng sẽ phân tán vào chất béo từ đó ảnh hƣởng tới phản ứng tạo hiđrua hóa của Se, kết quả là giảm hiệu suất hiđrua hóa của chúng. Các đƣờng biểu diễn đều đi xuống, chứng tỏ chất béo chỉ ảnh hƣởng đến tín hiệu đo chứ không ảnh hƣởng đến quá trình chuyển dạng Se. Nhƣ vậy cần phải loại bỏ bớt hàm lƣợng chất béo trong mẫu trƣớc khi thực hiện phản ứng hiđrua hóa.
Hình 3.6: Hiệu suất thu hồi các dạng Se và tổng dạng Se khi có mặt Stearin
3.4.2. Ảnh hưởng của protein abumin đến tín hiệu đo
Để khảo sát ảnh hƣởng của protein abumin tới phân tích dạng selen chúng tôi làm thí nghiệm tƣơng tự nhƣ mục 3.4.1, nhƣng chỉ thay chất béo stearin bằng protein abumin với khoảng nồng độ từ 10-300 ppb, kết quả phân tích và tính hiệu suất thu hồi đƣợc đƣa ra ở bảng 3.15:
Bảng 3.15: Kết quả xác định hàm lƣợng và hiệu suất thu hồi các dạng Se khi