Mục tiêu của đề tài là xây dựng quy trình phân tích các dạng selen gồm (Se(IV) vô cơ, Se(VI) vô cơ, Dimethyl Diselenide và Selenomethionine) bằng phƣơng pháp HVG-AAS kết hợp thuật toán hồi quy đa biến, sau đó phân tích hàm lƣợng 4 dạng Selen trong mẫu thủy-hải sản thực tế.
2.1.2. Nguyên tắc phương pháp xác định dạng Selen bằng HVG-AAS
Nguyên tắc phƣơng pháp là dựa trên sự chênh lệch hiệu suất phản ứng khử các dạng Se thành selenua bằng NaBH4 trong các môi trƣờng có nồng độ H+ khác nhau. Các phản ứng xảy ra khi khử 4 dạng Se khảo sát (Se(IV) vô cơ, Se(VI) vô cơ. Dimethyl Diselenide và Selenomethionine) nhƣ sau :
HSeO4- + BH4- + H+ → H2SeO2 + H3BO3 + H2O H2SeO2 + BH4- + H+ → SeH2 + H3BO3 + H2O
(CH3)nSe(O)(OH)4-n + BH4- + H+ → (CH3)nSe(OH)4-n + H3BO3 + H2O (CH3)nSe(OH)4-n + BH4- + H+ → (CH3)nSeH4-n + H3BO3 + H2O
Trong đó, n là số nhóm thế metyl trong hợp chất.
Dòng khí mang Ar sẽ dẫn SeH2 và các hợp chất metylselen khác sang vùng nguyên tử hóa: SeH2 t0 Se + H2 (CH3)nSeH4-n t0 nC + Se + (4 + 2n)H Se(r) t0 Se(k)
Định lƣợng Se sinh ra bằng phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử tại bƣớc sóng đặc trƣng của Se khi thay đổi nồng độ H+
trong dung dịch.
Các dạng Se khác nhau sẽ bị khử về selenua và metyl selen với hiệu suất khác nhau nên lƣợng nguyên tử Se tạo thành là khác nhau, tín hiệu đo đƣợc cũng khác nhau. Dựa trên chênh lệch tín hiệu giữa các dạng Se trong các môi trƣờng phản ứng lựa chọn để xây dựng mô hình hồi quy đa biến xác định đồng thời các
dạng Se dựa trên dung dịch chuẩn nồng độ selen và ma trận độ hấp thụ quang tại các nồng độ phân tích khác nhau của môi trƣờng phản ứng.
2.1.3. Nội dung nghiên cứu
Kế thừa các nghiên cứu về phân tích đồng thời các dạng selen bằng phƣơng pháp HVG-AAS kết hợp với chemometric trong nghiên cứu này, để hoàn thiện quy trình phân tích các dạng selen ra khỏi nền mẫu thực phẩm. Luận văn tập trung vào việc khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện bảo quản mẫu đến sự chuyển dạng của các dạng selen, cũng nhƣ nghiên cứu quá trình chiết tách các dạng selen ra khỏi nền mẫu và từ đó áp dụng để xác định dạng selen ở các mẫu hải sản, cần tiến hành các nghiên cứu gồm:
- Chuẩn hóa lại các điều xác định tổng hàm lƣợng selen bằng phƣơng pháp HVG-AAS
- Chuẩn hóa lại mô hình hồi qui đa biến theo phƣơng pháp PCR. - Nghiên cứu sự chuyển dạng và mất chất phân tích khi bảo quản mẫu
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất đi kèm trong nền mẫu thực phẩm và tách loại chúng.
- Đánh giá qua phân tích mẫu giả tự tạo, từ đó phân tích mẫu thực tế.
2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Hệ thống phân tích hấp thụ nguyên tử Shimadzu 6800 kèm theo bộ phận hidrua hóa (HVG), bình khí nén axetylen tính khiết, bình khí nén Argon;
- Máy ly tâm (MISTRAL 1000, Galekamp của Đức); - Máy rung siêu âm (Telsonic AG, Thụy Sỹ);
- Máy đo pH (Hanna-Italia), độ chính xác: ±0.01 pH;
- Cột chiết pha rắn C18: 1CC/100mg (hãng Supelco, công thức – Si(CH3)2C18H37);
- Bình định mức thủy tinh loại A, dung tích 10ml, 25ml, 50ml, 100ml, 250ml;
- Phễu, cốc, bình tam giác, đũa thủy tinh.
2.2.2. Hoá chất
- Axít clohydric HCl nồng độ 37%, (PA, Merck); - Axit stearic ≥99%, (PA, Merck);
- Natri hydrôxyt NaOH, (PA, Merck); - Etanol C2H5OH, (PA, Merck);
- Natri tentraborat NaBH4, (PA, Merck);
- Các loại hóa chất chuẩn các dạng selen khác nhau đều thuộc loại tinh khiết phân tích:
+Selen vô cơ Se(IV) - Na2SeO3- (Natri selenit 99%, hãng Sigma-Aldrich) + Selen vô cơ Se(VI) - Na2SeO4- (Natri selenat 99%, hãng Sigma-Aldrich) + Selen hữu cơ Se-Mt- C5H11NO2Se- (Selenomethionine 99% dạng lỏng , Sigma-Aldrich).
+ Selen hữu cơ DMDSe - (CH3)2Se2- (Dimetyl diselenua 98% dạng lỏng (d = 1,987g/mol), Sigma- Aldrich).
+ Mẫu cá , tôm chuẩn DORM-2, hàm lƣợng selen tổng 1,40 ± 0,09 mg/kg hóa chất.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn:
-Dung dịch chuẩn gốc Se(IV) (nồng độ 1000 mg/l): cân 1,376g Na2SeO3 cho vào bình định mức 1000 ml, thêm nƣớc cất siêu sạch, lắc cho tan hết và định mức bằng nƣớc cất siêu sạch đến vạch.
- Dung dịch chuẩn gốc Se(VI) (nồng độ 1000 mg/l): cân 1,320g Na2SeO4 cho vào bình định mức 1000 ml đã có sẵn 0,35 ml HNO3 đặc (d = 1,4) trong nƣớc cất siêu sạch, lắc cho tan hết và định mức bằng nƣớc cất siêu sạch đến vạch.
- Dung dịch chuẩn gốc Se-Mt (nồng độ 1000 mg/l): cân 0,101g Se-Mt cho vào bình định mức 100ml, hòa tan bằng dung dịch HCl 0,1M, lắc cho tan hết và định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,1M, dung dịch đƣợc bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh.
- Dung dịch chuẩn gốc DMDSe (nồng độ 1000 mg/l): hút 51,3µl (tức 0,102g) DMDSe cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng dung môi metanol. Dung dịch đƣợc bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh.
- Các dạng selen có nồng độ từ 0,5 đến 50 ppb đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000ppm hòa tan bằng dung dịch HCl có pH = 2, môi trƣờng của dung dịch đƣợc kiểm tra lại bằng máy đo pH.
- Stearin 1000 mg/l: cân 0,1 g stearin (M=281 g/mol) cho vào bình định mức 100ml, thêm metanol vào và lắc cho tan hết, tiếp tục định mức bằng metanol cho đến vạch.
- Dung dịch NaBH4 0,5% pha trong NaOH 0,2%: Cân 0,5g NaBH4 và 0,2g NaOH hòa tan bằng nƣớc cất để đƣợc 100g dung dịch.
2.2.3. Các phần mềm tính toán và xử lí số liệu phân tích
- Xử lý thống kê trên phần mềm và MINITAB 14.
- Lập trình tính toán theo phƣơng pháp hồi qui đa biến trên phần mềm Matlab 7.6.
2.3. Tiến hành thí nghiệm
2.3.1. Quy trình phân tích
2.3.1.1. Quy trình phân tích tổng hàm lượng Selen
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn chứa 4 dạng Se (IV), Se (VI), DMDSe, SeMt có nồng độ trong khoảng 1 – 50ppb, có pH = 2 đƣợc ( điều chỉnh bằng dung dịch HCl hoặc NaOH). Bơm mẫu Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMt với tốc độ 6 ml/phút, các dòng chất khử NaBH4 0,5% trong NaOH 0,2% và dòng HCl 6M có tốc độ 2ml/phút. Các điều kiện nguyên tử hóa và đo tín hiệu độ hấp thụ quang nguyên tử của dòng chất nhƣ sau:
- Vạch phổ: 196nm.
- Cƣờng độ dòng đèn catot rỗng (HCl): 20mA. - Chiều cao đèn nguyên tử hóa: 14mm.
- Tốc độ dòng khí cháy: 1,6L C2H2/8L không khí/phút. Tín hiệu thu đƣợc dƣới dạng độ hấp thụ nguyên tử Abs.
2.3.1.2. Quy trình phân tích đồng thời các dạng Selen
Pha các dung dịch chuẩn chứa hỗn hợp các dạng Se (Se(IV), Se(VI), Dimethyl Diselenide, Selenomethionine có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính 1- 50 ppb, đo tín hiệu các dung dịch này ở các điều kiện khử thành selenua và metylselen ở 5 môi trƣờng phản ứng là HCl 6M, HCl 4M, HCl 2M, HCl 1M, HCl (pH=2).
Nhập số liệu ma trận nồng độ các chất và ma trận tín hiệu Abs vào phần mềm Matlab, chạy chƣơng trình tính toán ma trận hệ số hồi qui theo thuật toán PCR và sử dụng phƣơng trình hồi quy đa biến để tìm nồng độ các dạng selen trong mẫu.
2.3.1.3. Quy trình xử lý và phân tích mẫu thực tế
Với mục đích nghiên cứu xác định hàm lƣợng các dạng selen trong mẫu hải sản, chúng tôi đặt mua mẫu hải sản (mẫu cá, mẫu tôm) còn tƣơi với lƣợng vừa đủ cho việc phân tích định lƣợng.
Các mẫu cá và tôm đƣợc thu thập 2 tháng 1 lần theo các địa điểm khác nhau trên hình 3.14, sau đó đƣa về phòng thí nghiệm để tiến hành tiền xử lý.
- Mẫu tôm: bóc vỏ, bỏ đầu chỉ lấy phần thịt cắt nhỏ.
- Mẫu cá: cắt đầu, làm vẩy, bỏ ruột, chỉ lấy phần thịt cắt nhỏ.
Sau đó mẫu thu đƣợc cho vào túi polyme có khóa kéo, ƣớp đá để bảo quản mẫu.
Trƣớc khi phân tích, mẫu đƣợc cân xác định khối lƣợng ban đầu và tiến hành đông khô mẫu mẫu tại -500C đến khối lƣợng không đổi, sau đó nghiền nhỏ thành bột mịn bảo quản trong trong ngăn mát tủ lạnh.
Mẫu cá, tôm sau khi đƣợc nghiền mịn cho vào ống nghiệm có nắp vặn PE, thêm 5ml dung môi Metanol/H2O theo tỷ lệ thể tích 9/1 lắc chiết siêu âm trong 40 phút và quay ly tâm trong thời gian 10 phút, tốc độ quay 2000 vòng/ phút. Lọc dịch trong trên giấy lọc băng vàng, phần cặn còn lại cho 5ml Metanol/ H2O tiếp tục thực hiện quy trình nhƣ trên 2 lần nữa.
Gộp dịch trong thu đƣợc sau 3 lần chiết lặp và cô đuổi dung môi ở 500C trong khí quyển N2 đến còn 1/3 thể tích dung dịch. Dịch chiết đƣợc lọc qua màng lọc 0,2µm để phân tích dạng selen.
2.3.1.4. Quy trình loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng có trong mẫu
Sự có mặt chất béo, protein,… gây ảnh hƣởng đến tín hiệu độ hấp thụ quang của mẫu nên cần loại bỏ. Để loại bỏ ảnh hƣởng của thành phần nền mẫu dùng cột chiết pha ngƣợc C18 để tách các chất phân cực nhƣ chất béo, protein… và một số chất ảnh hƣởng khác.
Trƣớc khi cho dung dịch chứa các dạng selen chảy qua cột phải hoạt hóa bằng cách cho nƣớc cất hai lần đã loại bỏ ion và đuổi oxi và để thấm ƣớt vật liệu nhồi, solvat hoá các nhóm chức của chất hấp phụ, đồng thời loại bỏ không khí và các chất bẩn trong cột. Cho dung dịch chứa mẫu phân tích chứa đã xử lý ở mục 2.3.1.3 chảy qua cột chiết pha rắn. Trong quá trình này phần lớn các dạng selen và dung môi từ từ rút ra khỏi cột. Phần nhỏ các dạng selen và các tạp chất đƣợc giữ lại trên cột.
Rửa giải các chất phân tích trên cột bằng dung môi chiết metanol/H2O (5/5). Quá trình này loai bỏ đƣợc tạp chất nhƣng vẫn thu đƣợc các dạng selen trong dung dịch phân tích. Các cột chiết pha rắn đƣợc tái sinh dùng lại 3 lần, và dùng dung môi metanol/H2O theo tỷ lệ thể tích (5/5) rửa giải để tái sinh cột.
2.3.2. Thuật toán và câu lệnh tính toán phương trình hồi quy đa biến
Phương pháp hồi quy cấu tử chính (PCR)
Thuật toán PCR giải trong Matlab nhƣ sau:
- Nhập ma trận nồng độ C (40x4) và ma trận tín hiệu đo độ hấp thụ quang A của 40 dung dịch chuẩn chứa 4 dạng Se cần phân tích tại các môi trƣờng khác nhau
- Bình phƣơng tập số liệu chứa biến phụ thuộc: D = A’*A
- Sử dụng một trong 3 hàm tính PC để xác định các PC. Câu lệnh sau sử dụng hàm SVD: [V S] = svd(D)
- Tính ma trận phần trăm phƣơng sai của các PC:
- Từ giá trị phần trăm phƣơng sai của các PC, căn cứ vào yêu cầu cụ thể của bài toán để quyết định chọn số PC làm cơ sở cho không gian mới của tập số liệu (4):
f = V(:,1:4)
- Chuyển đổi tập số liệu ban đầu và tính ma trận hệ số hồi qui: Aj = A*f
F = inv(Aj'*Aj)*Aj'*C Fj=f*F
- Nhập ma trận biến phụ thuộc của k mẫu cần định phân Ax(k*5) và tính nồng độ các dạng Se trong mẫu theo công thức: Cx=Ax*Fj
Hàm NIPALS tính các PC có nghĩa: Use [T L pc]= nipals2(A,nb) % % Trong đó T : Ma trận các trị riêng % L : Ma trận các vector riêng (PC) % pc: % của các PC
% A: Dữ liệu phổ đầu vào % nb: Số PC lựa chọn % % Sử dụng hàm NIPALS tính các PC function [Tprinc,Lprinc,pc]=nipals2(A,nbp) nb_ligne=size(A,1); E=A; nb=1; Tprinc=ones(nb_ligne,nbp); Lprinc=ones(nbp,length(E)); varo = norm( E ); varl = varo while nb<=nbp
voir=1; %etape 2
L(nb,:)=E(1,:); Lprinc=Lprinc'; %etape 3 Tprinc(:,nb)=E*Lprinc(:,nb); %etape 4 j=1; somme=1e15; T=Tprinc(:,nb); Lprinc=Lprinc'; L=Lprinc(nb,:); while somme>eps L=T'*E; L=L'/norm(L'); %etape 5 et 6 T=E*L; if j~=1 somme=sum(T-Ttmp); somme=somme^2; end; voir=voir+1; Ttmp=T; j=j+1; end; L=L'; Tprinc(:,nb)=T; Lprinc(nb,:)=L; %etape 7 E=E-Tprinc(:,nb)*Lprinc(nb,:);
var = norm( E );
pc = [ pc ( 100 * ( varl - var ) / varo ) ]; varl = var;
%etape 8 nb=nb+1; end;
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chuẩn hóa lại các điều kiện xác định tổng hàm lƣợng selen bằng phƣơng pháp HVG-AAS pháp HVG-AAS
3.1.1. Điều kiện đo phổ AAS xác định Se(IV)
Kế thừa các nghiên cứu trƣớc đó [4] về các điều kiện đo phổ AAS của Selen trên cùng các thiết bị đo, chúng tôi dùng dung dịch Se(IV) 10ppb để tiến hành khảo sát chuẩn hóa lại các thông số tối ƣu của máy đo phổ hấp thụ nguyên tử Shimazu 6800 bằng kỹ thuật hidrua hóa. Các thông số đƣợc khảo sát đơn biến, bằng cách cố định các thông số khác, sao cho độ hấp thụ ánh sáng đơn sắc của Se đạt cực đại và đảm bảo độ ổn định, độ lặp lại, độ bền của thiết bị đo. Kết quả khảo sát đƣợc tóm tắt qua bảng 3.1.
Bảng 3.1: Tóm tắt các điều kiện tối ƣu xác định Se(IV) bằng phƣơng pháp HVG-AAS Yếu tố Khoảng khảo sát Giá trị lựa chọn Yếu tố Khoảng khảo sát Giá trị lựa chọn Vạch phổ 196nm Môi trƣờng khử HCl 1M - HCl 10M HCl 6M Cƣờng độ dòng đèn 14 - 24mA 20mA Nồng độ chất khử NaBH4 0,1 - 1% 0,5% Chiều cao đèn nguyên tử hóa 14- 18mm 14mm Tốc độ dòng NaBH4 1,0- 2,2ml/phút 2ml/phút Tốc độ dòng khí C2H2 1- 2,4L/phút 1,6L/phút Tốc độ dòng mẫu 3-7ml/phút 6ml/phút Tốc độ dòng không khí 8L/phút Khoảng tuyến tính 0,5-40ppb 0,5-25ppb Sử dụng các điều kiện tối ƣu ở bảng 3.1 để tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử HCl đối với quá trình khử các dạng selen thành selennua trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất khử đối với quá trình khử các dạng selen thành selennua
Một số công trình nghiên cứu trƣớc đây [4] đã khảo sát nhiều hệ khử Se(IV) thành selenua và kết luận là hệ khử NaBH4/HCl cho kết quả tốt hơn cả. Các nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng quá trình khử trực tiếp Se(VI) thành selenua không thể đạt đƣợc hiệu suất 100% so với quá trình khử Se(IV) và cần thiết phải có quá trình khử sơ bộ ban đầu để chuyển các dạng Se khác nhau thành Se(IV) bằng các chất khử nhƣ HCl, KBr/HCl, Thioure, các điều kiện khác nhƣ bảng 3.1. Kết quả thực nghiệm về hiệu suất khử các dạng selen trong môi trƣờng HCl 6M thu đƣợc trong bảng 3.2:
Bảng 3.2: Hiệu suất khử các dạng Se bằng NaBH4 trong môi trƣờng HCl 6M
Dạng selen Nồng độ (ppb) Nồng độ sau khi khử Hiệu suất khử (%) So với Se(IV) Se(IV) 10 10 100 1% Se(VI) 10 8,7 86 2% Dimethyldiselenide 10 4,6 46 1% selenomethylonine 10 6,3 63 2%
Nhƣ vậy, để xác định tổng hàm lƣợng Se cần thực hiện quá trình khử các dạng Se(VI) thành Se(IV) trƣớc khi tiến hành hidrua hóa.
Chúng tôi thực hiện khảo sát lại hiệu suất khử của các chất và nhận thấy đƣợc rằng sử dụng các chất khử HCl 6M, KBr/HCl 1%, KI 0,5% đều cho kết quả tốt khi khử dạng Se(VI) vô cơ về Se(IV) vô cơ. Với cả 3 hệ khử này, chúng tôi nhận thấy chỉ có thể xác định tổng hàm lƣợng Se vô cơ một cách chính xác khi không có mặt các dạng hữu cơ trong mẫu. Kết quả khảo sát trên cho thấy không thể tiến hành phân tích chính xác hàm lƣợng Se vô cơ khi có mặt các dạng Se hữu cơ nếu không qua giai đoạn tách loại nhƣng đồng thời cũng mở ra khả năng xác định đồng thời