2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu trong phân lập, nuôi cấy và biệt hóa tế bào tế bào
2.3.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô
Tại Labo nuôi cấy, dây rốn đƣợc xử lý theo quy trình vô trùng. Rửa mô dây rốn bằng Betadin scrup nếu mô thu theo đƣờng đẻ tự nhiên. Cắt lọc dây rốn, loại bỏ lớp thạch và các mạch máu của dây rốn. Sát trùng màng dây rốn bằng cồn 70% thể tích. Rửa sạch mô bằng PBS để loại bỏ cồn và máu.
Các mẩu mô sau đó đƣợc đặt vào đĩa hoặc chai nuôi cấy nhựa với mật độ khoảng 1mẩu mô/5cm2
bề mặt nuôi cấy. Bổ sung môi trƣờng nuôi cấy vào đĩa nuôi, đây là môi trƣờng nuôi cấy tế bào gốc trung mô chuyên biệt do Mekostem cung cấp đƣợc nhƣợng quyền của công ty CRC Singapore.
Đặt đĩa nuôi trong tủ ấm và ẩm với 5% CO2 ở 370C. Thay môi trƣờng sau mỗi 2-3 ngày và theo dõi dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc cho đến khi thấy tế bào hình sao, hình thoi mọc ra khỏi mẩu mô. Khi số lƣợng tế bào đạt khoảng 50% độ che phủ bề mặt nuôi cấy thì tách tế bào bằng quy trình trypsin. Các tế bào đƣợc theo dõi dƣới kính hiển vi và đƣợc cấy chuyển sang đĩa khác ở mật độ 8000 tế bào/cm2. Sau đó tế bào đƣợc bảo quản lạnh sâu hoặc nhân rộng để làm các thí nghiệm hoặc ứng dụng tiếp theo.
Trong quá trình nuôi cấy mô, hàng ngày theo dõi dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc về: Thời gian tế bào tách khỏi mẫu mô, hình thái tế bào mới tách.
Sau khi cắt nhỏ thành các mẩu có kích thƣớc 0,2 x 0,2 cm, đặt các mẩu mô trong đĩa nuôi cấy nhựa và bổ sung môi trƣờng chuyên biệt đƣợc cung cấp từ Ngân hàng tế bào gốc Mekostem, đặt các đĩa mô vào tủ ấm 370C với 5% CO2. Thay môi trƣờng nuôi cấy từ 2-3 lần/ tuần và theo dõi đến khi các tế bào hình sao hay hình thoi tách ra khỏi mẫu mô và phát triển đạt 50%-70% bề mặt đĩa thì tiến hành tách tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin. Các tế bào đƣợc nhân lên đến thế hệ cấy chuyển thứ 3-4 dùng vào nghiên cứu chế tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì.
Hình 2.1. Cấu trúc mô dây rốn
Lớp tế bào biểu mô tương tự màng ối (1); lớp tế bào gốc trung mô màng dây rốn (2); lớp tế bào gốc trung mô lớp Wharton’ jelly (3). Các tế bào được sử
dụng trong nghiên cứu này thuộc vị trí số 2.
* Nguồn: theo Katsuhiro Kita và Cs (2009) [90]
2.3.1.2. Cấy chuyển nhân rộng số lƣợng tế bào gốc trung mô dây rốn
Tách và nhân rộng số lƣợng tế bào đƣợc áp dụng theo quy trình cấy chuyển có sử dụng trypsin, các bƣớc nhân rộng đƣợc mô tả chi tiết nhƣ sau:
Kiểm tra cẩn thận tình trạng tế bào nuôi cấy để phát hiện các dấu hiệu bị ô nhiễm. Đánh giá sơ bộ mật độ tế bào bằng mức độ phủ kín bề mặt (confluence), pH môi trƣờng...trƣớc khi tiến hành cấy chuyển.
Hút bỏ dịch nổi trong chai nuôi cấy. Rửa bề mặt đĩa nuôi cấy tế bào bằng dung dịch đệm PBS với số lƣợng 0,2 ml/cm2
.
Thêm dung dịch Trypsin/EDTA với số lƣợng 0,1mL/cm2. Đặt chai hoặc đĩa nuôi cấy vào tủ ấm theo dõi 5-10 phút, cho thêm 0,1 – 0,2 mL/cm2
môi trƣờng nuôi cấy, thu tế bào vào ống ly tâm, đếm số lƣợng tế bào. 1
2 3
4
Ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong khoảng thời gian 10 phút. Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm, cho thêm môi trƣờng nuôi cấy.
Khối tế bào thu đƣợc sẽ đƣợc dùng vào các thí nghiệm tiếp theo hoặc cấy chuyển sang chai khác mật độ 5000 TB/cm2
hoặc đƣợc bảo quản lạnh sâu.
2.3.1.3. Đánh giá khả năng tạo colony của tế bào
Khả năng tạo colony của tế bào mới tách đƣợc đánh giá nhƣ sau:
- Tế bào mới tách ra khỏi mẫu mô, mật độ tế bào đạt khoảng 50% độ che phủ.
- Tách tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin
- Hỗn dịch các tế bào đơn lẻ đƣợc chuẩn bị và cấy trong đĩa nuôi cấy nhựa có đƣờng kính 60mm ở mật độ là 50 tế bào /cm2. Đĩa nuôi cấy sau đó đƣợc duy trì trong 2-3 tuần để theo dõi sự phát triển của các colony. Đĩa tế bào nuôi cấy sau đó đƣợc cố định bằng cồn tuyệt đối và nhuộm giemsa, một nhóm tế bào đƣợc xác định là đơn vị colony khi có ít nhất là 50 tế bào. Khả năng tạo colony (CF – E) đƣợc tính toán theo tỷ lệ % số colony đạt đƣợc so với số tế bào đƣợc cấy. Cụ thể các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
B1/ Cấy tế bào cần làm thí nghiệm trong đĩa d=60mm với mật độ tế bào
50TB/cm2, mỗi đĩa cho 4ml môi trƣờng nuôi cấy, thay môi trƣờng sau mỗi 3 ngày.
B2/ Theo dõi tạo colony trong 3 tuần, ghi chép số liệu 5 ngày/ lần về:
- Hình thành colony chƣa?
- Mỗi colony có khoảng mấy tế bào? - Hình thái tế bào?
B3/ Nhuộm giemsa sau 3 tuần
B4/ Tính tỷ lệ % số colony/số tế bào đƣợc cấy, mỗi colony khi đó đƣợc
2.3.1.4. Xác định số lƣợng tế bào trong nuôi cấy
Nhằm xác định số lƣợng tế bào thu đƣợc từ mô và để cấy chuyển theo đúng tỷ lệ và đánh giá đƣợc khả năng nhân lên của TB.
Phƣơng pháp tiến hành trong buồng đếm Neubauer.
Tiến hành trypsin, lấy vào ống nghiệm 1ml hỗn dịch tế bào đã trypsin. Lấy hỗn dịch TB bằng đầu pipet pasteur, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm và để hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm. Đếm số lƣợng tế bào dƣới kính hiển vi trên đơn vị diện tích bằng 1mm2
.
Số lƣợng TB đƣợc tính theo công thức: C = n/v (n: số lƣợng TB đã đếm đƣợc trong buồng đếm, v: thể tích đếm (ml), C: mật độ TB (TB/ml). Trong buồng đếm Neubaeur có thể tích 0,1mm3
= 1.10-4 ml do đó công thức tính là:
C = n x 104/ml
2.3.1.5. Đánh giá hình thái tế bào
Hàng ngày quan sát các đĩa tế bào nuôi cấy hay thí nghiệm dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc để đanh giá sự tăng trƣởng của tế bào và hình dạng của chúng. Ngoài ra, các phƣơng pháp nghiên cứu hỗ trợ để đánh giá hình thái và siêu cấu trúc nhƣ sau:
Đánh giá hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm giemsa
Các mẫu tế bào nuôi cấy hay thí nghiệm theo tiến độ khi cần đánh giá hình thái thì tiến hành hút bỏ môi trƣờng nuôi cấy. Rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS loại 1X.
Cố định tế bào bằng cồn tuyệt đối trong 10 phút và để khô trong điều kiện phòng.
Nhuộm tế bào bằng dung dịch Giemsa trong 10 phút, rửa nƣớc và để khô sau đó đánh giá hình thái tế bào dƣới kính hiển vi quang học.
Đánh giá hình thái mô bằng phƣơng pháp nhuộm HE
Đánh giá hình thái mô bằng phƣơng pháp nhuộm HE đƣợc tiến hành tại Bộ môn Mô Phôi – Học Viện Quân Y.
Cố định mẫu vật liệu hoặc mô nghiên cứu bằng dung dịch Bouin, sau đó chuyển vào dung dịch cồn có nồng độ tăng dần 700
, 800, 900, 1000 và xylen 1, xylen 2 trong 3 giờ để đẩy cồn ra khỏi bệnh phẩm.
Đúc bệnh phẩm trong parafin nóng chảy ở 560
C thành từng bloc riêng và đánh số thứ tự.
Các bloc đƣợc cắt trên máy Microtome, mỗi lát cắt dầy 5m. Mỗi bloc cắt 5 tiêu bản, đặt lát cắt lên lam kính sạch và dán bằng nƣớc albumin, để tiêu bản trong tủ ấm 370 trong vòng 12 giờ. Sau đó tẩy parafin bằng xylen 1, xylen 2, tiếp theo dùng cồn 1, và cồn 2 để tẩy xylen.
Quan sát tiêu bản dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 5 - 100 lần, nhận xét sự biến đổi hình thái và cấu trúc mô.
Đánh giá hình thái siêu cấu trúc
Đánh giá siêu cấu trúc mô tế bào đƣợc tiến hành tại labo kính hiển vi điện tử của Học Viện Quân Y.
Cố định mô sinh thiết là tấm tế bào gốc biệt hóa theo hƣớng nguyên bào sợi trong dung dịch glutaraldehyt trong 3 giờ, sau đó cố định trong acid osmic, rửa trong dung dịch polat.
Khử nƣớc bằng đặt mẫu mô nghiên cứu trong các dung dịch cồn ở nồng độ khác nhau từ 500
- 1000. Tiếp theo đặt trong propylenoxyt và tẩm đúc bằng hỗn hợp đúc.
Cắt trên máy siêu cắt ultramicrotom, lát cắt mỏng 500 A0
. Sau đó nhuộm bệnh phẩm trong dung dịch uranyl acetat.
Quan sát bệnh phẩm dƣới kính hiển vi điện tử 30, 40, 50, 60, 80 KV, độ phân giải 5 A0, độ phóng đại từ 1000 - 30.000 lần.
Xét nghiệm này cho phép đánh giá khả năng tổng hợp chế tiết nội bào.
2.3.1.6 Phƣơng pháp khảo sát biểu hiện của các kháng nguyên HLA của tế bào gốc trung mô
Các tế bào gốc trung mô sau phân lập tiếp tục đƣợc tăng sinh bằng phƣơng pháp cấy chuyền đến thế hệ thứ 3 (P3). Sau đó, thu hoạch tế bào để phân tích kháng nguyên HLA. Từng loại HLA đƣợc phân tích theo kỹ thuật western blot và flowcytometry dƣới đây:
Phân tích biểu hiện của HLA-G và HLA-E bằng kỹ thuật western blot
Tế bào gốc trung mô dây rốn đƣợc nghiền bằng phƣơng pháp siêu nghiền với sóng siêu âm. Lấy 100 g protein siêu nghiền của tế bào cho vào mỗi giếng và tách bằng điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 14%. Sau khi tách bằng SDS-PAGE, protein của tế bào đƣợc điện di theo chiều thứ hai để chuyển lên màng nitrocellulose. Sau khi block các vị trí không có kháng nguyên bằng dung dịch BSA 2%, màng chứa kháng nguyên đƣợc ủ với các kháng thể thứ nhất kháng HLA-G hoặc kháng HLA-E. Sau khi ủ với kháng thể thứ hai gắn enzym, phản ứng kháng nguyên-kháng thể đặc hiệu với HLA- G hoặc HLA-E đƣợc hiện mầu bằng cơ chất đặc hiệu.
Kỹ thuật đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Công ty CellResearch Corporation, Đại học Quốc gia Singapore.
Phân tích HLA-DR bằng kỹ thuật flowcytometry
Tế bào gốc trung mô sau khi cấy chuyền tăng sinh ở thế hệ thứ 3 đƣợc thu nhận bằng cách xử lý với trypsin/EDTA 0,25%. Huyền phù tế bào đơn đƣợc ly tâm ở tốc độ 3.000 vòng/phút trong 5 phút và chỉnh về mật độ 1.105
trong 100 µL để nhuộm với kháng thể kháng HLA-DR. Lấy 100 µL huyền dịch chứa 105 tế bào để nhuộm với 20 µL kháng thể tƣơng ứng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, bổ sung 900 µL dung dịch FACSflow và làm lạnh ở
4C trong 15 phút trƣớc khi sử dụng để phân tích. Tất cả các tế bào ở các mẫu nhuộm khác nhau đều đƣợc phân tích bằng cùng một quy trình phần mềm CellQuest Pro trên máy FACSCalibur (BD Bioscience, Mỹ), trong đó mỗi mẫu tế bào đều đƣợc phân tích tối thiểu là 10.000 tế bào.
Kỹ thuật đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm tế bào gốc thuộc trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
2.3.1.7 Xác định tính sinh miễn dịch của tế bào gốc
Nguyên liệu và chuẩn bị
- Tế bào gốc: là dòng tế bào cùng nguồn gốc và thế hệ tế bào đã sử
dụng ghép cho thỏ trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm. Các tế bào này đƣợc bảo quản lạnh sâu -1520C trong môi trƣờng cơ bản chứa 10% DMSO. Trƣớc khi dùng làm xét nghiệm miễn dịch, các tế bào này đƣợc rã đông và nuôi cấy trở lại đĩa nhựa cho đến khi các tế bào ổn định tồn tại và bắt đầu nhân lên.
Mẫu tế bào đƣợc chia làm hai để phân tích miễn dịch thỏ với các kháng nguyên bề mặt tế bào và một nửa dùng để phân tích các kháng nguyên nội bào.
Các mẫu tế bào dùng phân tích kháng nguyên bề mặt tế bào đƣợc cấy vào đĩa 96 giếng và chờ đến khi đạt mức độ che phủ toàn bộ thì tiến hành loại bỏ dịch nổi nuôi cấy, rửa tế bào một lần bằng PBS và làm phản ứng ELISA bằng cách trộn với huyết thanh thỏ ở các nồng độ khác nhau pha loãng ở các tỷ lệ.
Phần tế bào dùng xác định kháng nguyên nội bào đƣợc ly giải bằng siêu âm, phá vỡ tế bào, định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford: Protein kháng nguyên đƣợc gắn vào đáy giếng ELISA với nồng độ 5 microgam/ml pha trong dung dịch coating buffer pH 9,6.
Tiến hành ủ đĩa ELISA qua đêm ở 40C sau đó rửa 5 lần bằng PBS – T 0,05%. Sau đó cố định bằng dung dịch BSA 1% trong 2 giờ ở 370
C. Tiếp tục rửa lại 5 lần bằng PBS – T 0,05%.
Gói kín bảo quản ở -200C cho đến khi đem chạy phản ứng ELISA.
- Huyết thanh thỏ: các mẫu máu thỏ đƣợc lấy ở 4 thời điểm: Bắt đầu
nghiên cứu ghép tế bào gốc - D0 và các thời điểm sau đó là D15, D30, D60. Tách mẫu máu lấy huyết thanh và bảo quản lạnh sâu -800C cho đến khi đủ mẫu thì tiến hành phân tích bằng kỹ thuật ELISA.
Phương pháp phân tích miễn dịch ELISA
Khi tiến hành phản ứng ELISA, huyết thanh thỏ đƣợc pha loãng bằng dung dịch đệm PBS ở pH 7,4 với các tỷ lệ pha loãng 1/500, 1/100, 1/50, 1/10. Nhỏ huyết thanh thỏ đƣợc pha loãng nhƣ trên vào các đĩa theo vị trí đã xác định với thể tích 100 microlit, ủ ở 370C trong vòng 45 phút sau đó rửa 5 lần bằng PBS-T 0,05%.
Tiếp tục ủ các mẫu trên với kháng thể gắn enzym HRP ở 370C trong 45 phút sau đó rửa 5 lần với PBS-T 0,05%.
Cho cơ chất OPD 0,5microgam/ml trong vòng 5 phút, dừng phản ứng bằng H2SO4 nồng độ 2N và đọc kết quả ở bƣớc sóng 450nm trên hệ thống DTX880 của hãng Backman Coulter.
2.3.1.8. Biệt hóa tế bào gốc mô thành tế bào dạng nguyên bào sợi
Môi trường cảm ứng biệt hóa
Môi trƣờng cơ bản: DMEM đƣợc bổ sung 5% FBS và 1% kháng sinh Các chất bổ sung bao gồm:
TGF-beta: 5ng/ml
Insulin-like growth factor (IGF)-II: 5ng/ml EGF: 1microgam/ml
Insulin: 5microgam/ml , bFGF: 1ng/ml
Vitamin C: 2,5 mg/L
Các bước biệt hóa
- Cấy tế bào trong đĩa nuôi ở mật độ 5000/cm2. Duy trì tế bào gốc trung mô trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào gốc tăng trƣởng trung mô dây rốn. Thay môi trƣờng sau môi 2-3 ngày
- Khi tế bào bám ổn định vào bề mặt đĩa nhựa nuôi cấy thì hút bỏ môi trƣờng tăng trƣởng. Tráng rửa tế bào trong đĩa nuôi bằng PBS. Duy trì tế bào trong đĩa nuôi bằng môi trƣờng nuôi cấy cảm ứng nguyên bào sợi.
- Hàng ngày thay thế ½ môi trƣờng trong đĩa bằng môi trƣờng mới. Theo dõi sự phát triển cũng nhƣ biến đổi hình thái tế bào trên kính hiển vi soi đảo ngƣợc, các xét nghiệm đƣợc khảo sát sau 5 ngày.
Xác định khả năng tạo tấm vật liệu tương đương trung bì của tế bào
- Khi tế bào phát triển đạt 100% độ che phủ thì hút bỏ môi trƣờng cảm ứng nguyên bào sợi.
- Duy trì tế bào trong môi trƣờng vài tuần nữa trong môi trƣờng đƣợc thay thế bằng hỗn hợp pha trộn DMEM và Ham’s F12 tỷ lệ 3:1 và đƣợc bổ sung 10% FBS cùng với 5ng/ml EGF, 5microgam/ml inslin, 0,4 microgam/ml hydrocortisone, 5microgam/ml transfferin và 1x10-11 M triiodothyronine. Môi trƣờng này đƣợc thay thế 3 lần/ tuần. Theo dõi đến khi thấy tế bào phát triển chồng lấn lên nhau thì có thể để tự bong hoặc dùng Cell lifter cạo nhẹ để tạo tấm vật liệu dạng nhƣ trung bì.
2.3.1.9. Xét nghiệm ELISA collagen typ I trong dịch nổi tế bào biệt hóa
- Kháng thể đơn dòng thứ nhất đƣợc cố định trên nền giếng. - Mẫu xét nghiệm đƣợc cho vào giếng và ủ.
- Sau đó rửa sạch phần không bám đích đặc hiệu, kháng thể đơn dòng thứ hai đƣợc thêm vào, đây là kháng thể đã đƣợc gắn sẵn enzyme Horseradish