chứng ở P1 đa số hình sao và hình thoi. (B) Tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô P5, tế bào thuôn dài, chủ yếu hình thoi, các tế bào nằm cạnh nhau và phát triển đạng xoáy. (giemsa 100x)
Bảng 3.6. Tỷ lệ % hình dạng nhân tế bào biệt hóa
Thế hệ tế bào
Nhân tế bào biệt hóa Hình tròn Hình trứng Đang phân
chia Nhân quái
P5 70,7 26,2 3,1 00
P10 38,8 58,0 3,4 00
P15 17,4 80,9 1,7 00
Tỷ lệ tế bào có nhân hình trứng là hình dạng đặc trƣng của nhân nguyên bào sợi, hình dạng này tăng dần theo các thế hệ tế bào biệt hóa. Các tế bào vẫn giữ đƣợc khả năng phân chia.
Ảnh 3.9. Hình dạng tế bào và bào tương tế bào biệt hóa dạng nguyên bào sợi, tế bào dạng hình thoi, dài (soi nổi 50X)
Ảnh 3.10. Hình dạng nhân và bào tương tế bào biệt hóa dạng nguyên bào sợi. Tế bào dạng hình thoi, dài nhân hình trứng (giemsa 100X)
A B
Ảnh 3.11. Hình thái siêu cấu trúc ảnh tế bào biệt hóa. Tế bào có những nếp gấp bào tương các bào quan phong phú, có nhiều hạt chế tiết (A những nếp gấp bào tương các bào quan phong phú, có nhiều hạt chế tiết (A -5.000X); Lưới nội bào có hạt phát triển dầy đặc trong bào tương, một số có hạt chế tiết, (B - 30.000X)
3.1.3.2. Khả năng chế tiết collagen và tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì của tế bào gốc trung mô
Bảng 3.7. Hàm lượng collagen hòa tan (µg/ml)
Mẫu xét nghiệm Nhóm tế bào Nhóm chứng (TBGTM) Nhóm nghiên cứu (NBS biệt hóa) P
Môi trƣờng nuôi cấy
(n=5) 0,045 ± 0,002 0,046 ± 0,001 >0,05 Dịch nổi nuôi cấy
(n=5) 0,069 ± 0,003 0,297 ± 0,011 <0,01
P >0,05 <0,001
Ở môi trƣờng tăng trƣởng, hàm lƣợng collagen chính là lƣợng collagen hòa tan ở huyết thanh bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Hàm lƣợng collagen ở dịch nổi nuôi cấy trƣớc khi biệt hóa tế bào là giống nhau giữa mẫu tế bào chuẩn bị biệt hóa và mẫu tế bào không tiến hành biệt hóa.
Trong dịch nổi nuôi cấy tế bào gốc trung mô, tuy hàm lƣợng collagen ở dịch nổi nuôi cấy tế bào có cao hơn so với trong môi trƣờng tăng trƣởng nhƣng không đáng kế.
Hàm lƣợng collagen ở dịch nổi tế bào nguyên bào sợi biệt hóa từ tế bào gốc trung mô cao hơn so với chính môi trƣờng tăng trƣởng trƣớc khi nuôi cấy (p<0,001) và cao hơn so với dịch nổi nuôi cấy tế bào gốc trung mô trong cùng khoảng thời gian nuôi cấy (p<0,01).
Nhƣ vậy, tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô dây rốn có khả năng tổng hợp collagen mạnh hơn so với tế bào gốc trung mô trƣớc biệt hóa.
Hai tuần nuôi cấy tính từ sau khi tế bào đạt 100% độ che phủ, các tế bào trung mô đƣợc duy trì trong môi trƣờng nuôi cấy biệt hóa, các tế bào hình thoi dài phát triển chồng lấn lên nhau khoảng 2-3 lớp đan chéo nhau theo nhiều hƣớng và có sự liên kết với nhau (ảnh 3.12a). Trong khi đó tế bào nuôi cấy trong điều kiện truyền thống không có yếu tố bổ sung, các tế bào vẫn phát triển đơn lớp, các tế bào nhiều hình dạng nằm cạnh nhau trong đó có các tế bào hình sao, hình thoi ngắn hơn (ảnh 3.12b).
A B
Ảnh 3.12. Tế bào mọc thành hai lớp đan chéo nhau ở ngày thứ 5 trong môi trường biệt hóa (a), trong khi tế bào vẫn duy trì 1 lớp ở môi trong môi trường biệt hóa (a), trong khi tế bào vẫn duy trì 1 lớp ở môi trường tăng trưởng cho tế bào gốc trung mô (b), (hình ảnh soi trên kính hiển vi đảo ngượi - 50X)
Khi tế bào gốc trung mô màng dây rốn phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy, tế bào cũng có xu hƣớng tạo ra 2 lớp chồng lấn lên nhau chứ không phát triển hình cuộn xoáy nhƣ Fibroblasts trung bì.
Theo dõi các ngày sau thay môi trƣờng biệt hóa, thấy tế bào mọc mạnh xếp chồng lấn lên nhau, khoảng ngày thứ 6-8.
Ngày thứ 10, lớp tế bào có xu hƣớng bong bật khỏi bề mặt đĩa, lắc nhẹ đĩa hoặc dùng đầu pipet gạt nhẹ là có thể tạo ra tấm tế bào. Tấm tế bào chỉ co nhỏ hơn diện tích đáy đĩa một chút, còn khoảng = 2/3 diện tích đĩa nuôi.
A B
Ảnh 3.13. Duy trì môi trường nuôi cấy 2 tuần, tế bào trong môi trường biệt hóa tạo thành tấm tế bào gốc trung mô, các tế bào mọc thành hai -3 lớp đan chéo nhau, tấm vật liệu bắt đầu bong (a), bờ mép dịch chuyển về phía trung tâm đĩa (b). (Soi nổi - 50X)
Về khía cạnh mô học, tấm vật liệu có chứa không chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào.
Tấm vật liệu cho thấy trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi.
A B
Ảnh 3.14. Hình ảnh đại thể tấm vật liệu tương đương trung bì. (a) tấm vật liệu tạo ra sau 2 tuần nuôi cấy tế bào gốc trung mô trong môi trường biệt hóa thành nguyên bào sợi trong, tấm vật liệu dai và dễ tách ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. (b) Hình thái cấu trúc trên kính hiển vi quang học nhuộm HE của tấm vật liệu tương đương trung bì, tấm vật liệu có chứa không chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào, Tấm vật liệu cho thấy trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi và đệm gian bào tương đối dày. (HE, 50X)
3.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM 3.2.1. Thay đổi một số chỉ số toàn thân và xét nghiệm của thỏ trong ghép tế bào gốc trung mô
2.32 1.96 2.06 2.13 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 kg D0 D5 D10 D15
Biểu đồ 3.6. Thay đổi cân nặng thỏ nghiên cứu
Qua biểu đồ 3.6 cho thấy: Trọng lƣợng thỏ giảm ở những ngày đầu sau khi gây bỏng thực nghiệm.
Ở thời điểm 10 ngày sau khi gây bỏng (5 ngày sau khi ghép tấm trung bì), cân nặng của thỏ bắt đầu hối phục.
Đến thời điểm 15 ngày sau khi gây bỏng (10 ngày sau khi ghép tấm trung bì), cân nặng của thỏ trở về gần với giá trị ban đầu trƣớc khi gây bỏng.
Nhƣ vậy, sự giảm trọng lƣợng trong những ngày đầu sau gây bỏng là do tính chất của chấn thƣơng cấp tính, đau đớn, vết thƣơng bỏng rộng và sâu.
Bảng 3.8. Thay đổi các chỉ số huyết học thỏ nghiên cứu Chỉ số Thời điểm Chỉ số Thời điểm D0 D5 D10 Số lƣợng hồng cầu (x1012/L) 5,56 1,67 5,67 1,69 5,84 0,12 Huyết tắc số (g/L) 120,13 1,44 125,58 2,92 131,1 2,81 Hematocrit (%) 34,41 1,81 37,25 1,56 38,10 2,10 Số lƣợng bạch cầu (x109/L) 5,26 0,36 8,27 0,72 6,26 0,56 Bạch cầu N (%) 23,05 2,41 19,90 1,67 20,69 2,42 Bạch cầu L (%) 58,24 4,30 62,20 2,26 61,58 2,19
Số lƣợng hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố và chỉ số hematocrit giảm nhẹ ở thời điểm 5 ngày sau bỏng và bắt đầu phục hồi ở thời điểm bắt đầu nghiên cứu cấy ghép tế bào điều trị vết thƣơng. Các chỉ số này phục hồi hoàn toàn vào thời điểm ngày thứ 10 nghiên cứu (ngày thứ 15 sau bỏng).
Số lƣợng bạch cầu tăng nhẹ ở thời điểm sau gây bỏng sau đó dần trở về bình thƣờng, không thấy dấu hiệu tăng bạch cầu ở các thời điểm sau ghép tế bào.
Bạch cầu đa nhân trung tính (N) không có dấu hiệu tăng trong khi bạch cầu lympho (L) có xu hƣớng tăng ít tại các thời điểm nghiên cứu vào ngày thứ 5 và thứ 10.
Bảng 3.9. Thay đổi các chỉ số sinh hoá máu liên quan chức năng thận Chỉ số Chỉ số Thời điểm D0 D5 D10 Glucose (mmol/L) 4,79 0,31 4,96 0,35 5,27 0,33 Ure (mmol/L) 5,34 0,47 5,2 0,41 5,10 0,27 Creatinin (mol/L) 93,8 4,86 94,6 5,48 96,04 5,63
Các chỉ số sinh hoá máu thể hiện chức năng thận và chuyển hoá không có sự thay đổi nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu.
Giá trị các xét nghiệm này luôn trong giới hạn bình thƣờng.
Bảng 3.10. Hoạt độ enzym GOT, GPT huyết thanh
Chỉ số
Thời điểm
D0 D5 D10
SGOT (U/L) 50,16 2,81 67,54 5,37 52,98 3,14 SGPT (U/L) 54,14 5,38 69,56 5,35 68,13 4,63
Hoạt độ enzyme GOT, tăng nhẹ ở ngày thứ 5 sau đó giảm nhanh xuống mức độ bình thƣờng vào ngày thứ 10.
3.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thƣơng
3.2.2.1. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới diễn biến lâm sàng tại chỗ vết thƣơng
Bảng 3.11. Diễn biến lâm sàng vết thương bỏng thực nghiệm
Thời điểm Vết thƣơng Vùng A Vùng B D0 - Nền vết thƣơng ẩm, giả mạc bám dễ bóc, ít viêm nề, tiết dịch vừa. - Bờ mép vết thƣơng viêm nề nhẹ.
- Nền vết thƣơng ẩm, giả mạc bám dễ bóc, ít viêm nề, tiết dịch vừa. - Bờ mép vết thƣơng viêm nề nhẹ.
D5
- Vết thƣơng sạch, tiết dịch ít. Vẩy tiết màu vàng sậm, phía dƣới nền có tổ chức hạt và dễ rƣớm máu. Vết thƣơng không có mùi hôi.
- Bờ mép vết thƣơng không viêm nề, không có ban dát sẩn.
- Vết thƣơng sạch, tiết dịch ít. Vẩy tiết dễ bóc, màu vàng nhạt, cạo sạch lớp vẩy tiết bên dƣới dễ chảy máu. Vết thƣơng không có mùi hôi.
- Bờ mép vết thƣơng còn viêm nề và xung huyết nhẹ.
D10
- Diện tích vết thƣơng thu nhỏ, nền có tổ chức hạt đẹp màu đỏ tƣơi. - Bờ mép vết thƣơng không có ban dát sẩn, xuất hiện rõ biểu mô hóa vào trung tâm vết thƣơng.
- Diện tích vết thƣơng co nhỏ lại nhƣng lớn hơn so với vùng A. Nền vết thƣơng ẩm, sạch, màu hồng nhạt, dịch tiết vừa. - Bờ mép VT không viêm nề. D15 - Nền vết thƣơng phẳng, không co dúm.
- Quầng biểu mô hóa từ bờ mép quan sát rõ.
- Nền vết thƣơng phẳng, rƣớm máu, có dấu hiệu co rút vết thƣơng
- Có biểu mô hóa từ bờ mép vết thƣơng lan vào trung tâm.
Bảng 3.12. Thay đổi diện tích vết thương bỏng
Thời điểm
Tỷ lệ % diện tích vết thƣơng đã liền
P
Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30)
D5 26,53 ± 12,04 25,84 ± 11,40 0,601 D10 77,44 ± 12,24 68,76 ± 11,14 < 0,01 D15 93,23 ± 3,74 87,36 ± 4,78 < 0,001 Ngày thứ 5, diện tích vết bỏng của vùng A khỏi nhanh hơn so với vùng B. Tuy nhiên, diện tích vết bỏng khỏi của vùng A và vùng B trong những ngày đầu sau ghép khác nhau không có ý nghĩa thống kế (p=0,601).
Ngày thứ 10 và 15, diện tích vết bỏng của vùng A liền nhanh vùng B rệt hơn (p<0,001).
Bảng 3.13. Tốc độ liền vết thương
Thời điểm Diện tích vết thƣơng thu hẹp (cm
2 /ngày) P Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Ngày thứ 1 - 5 0,93 ± 0,32 0,90 ± 0,29 0,488 Ngày thứ 5 – 10 1,77 ± 0,74 1,25 ± 0,28 <0,01 Ngày thứ 1 – 10 1,41 ± 0,33 1,28 ± 0,19 <0,01 Ngày thứ 1 - 15 1,12 ± 0,16 1,04 ± 0,13 < 0,01 Tốc độ thu hẹp vết thƣơng giữa vùng A và vùng B trong 5 ngày đầu khác nhau nhƣng chƣa có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nhƣng nếu so sánh sự thay đổi tốc độ thu hẹp vết thƣơng giữa vùng A và vùng B trong khoảng thời gian từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 10 thì sự khác nhau có ý nghĩa thống với p<0,01.
Bảng 3.14. Liên quan thời gian và số vết thương liền hoàn toàn
Thời gian
Số vết thƣơng liền hoàn toàn
P Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Số thỏ Tỷ lệ % Số thỏ Tỷ lệ % Trƣớc 15 ngày 0 0 0 0 > 0,05 Ngày 16-20 14 46,67 12 40 > 0,05 Sau 20 ngày 16 53,33 18 60 > 0,05 Tổng 30 100 30 100
Trong giai đoạn 16 – 20 ngày, tỷ lệ vết bỏng vùng A khỏi hoàn toàn (46,67%) cao hơn so với vùng B ( 40%), tuy nhiên chƣa có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3.15. Diện tích vùng biểu mô hóa sau khi liền
Thời điểm Diện tích (cm
2 ) P Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) D5 4,68 ± 1,64 4,50 ± 1,48 0,488 D10 14,18 ± 3,33 12,52 ± 2,83 <0,05 D15 16,95 ± 2,31 15,74 ± 1,93 <0,05
Diện tích vùng biểu mô hóa ở vùng A lớn hơn vùng ở vùng B và có ý nghĩa thống kê với p<0,05 vào ngày nghiên cứu thứ thứ 10 và 15.
Ảnh 3.15. Vết bỏng sâu ngày thứ 5 sau bỏng đã được cắt lọc sạch hoại tử, chuẩn bị ghép tế bào gốc trung mô. Vùng nghiên cứu và vùng đối chứng tương đương nhau về độ sâu và diện tích.
Ảnh 3.16. Vết bỏng ở ngày nghiên cứu thứ 5, vùng A có dấu hiệu biểu mô hóa, vùng B có dấu hiệu viêm và xung huyết bờ mép vết thương.. biểu mô hóa, vùng B có dấu hiệu viêm và xung huyết bờ mép vết thương..
D0
Ảnh 3.17. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 15, cả 2 vùng đều có tổ chức hạt đẹp và biểu mô hóa từ bờ mép vào trung tâm vết thương .Diện tích vết hạt đẹp và biểu mô hóa từ bờ mép vào trung tâm vết thương .Diện tích vết thương vùng A, thu hẹp hơn so với vùng B.
Ảnh 3.18. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 20, vùng A khỏi hoàn toàn, sẹo mềm mại, màu trắng hồng, tương đồng với da lành. Trong khi đó vùng sẹo mềm mại, màu trắng hồng, tương đồng với da lành. Trong khi đó vùng
B vẫn còn khoảng 2cm2
vết thương chưa liền, vùng sẹo phẳng nhưng hơi cứng cộm.
D15
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô đến thay đổi hình thái cấu trúc mô vết thƣơng
Bảng 3.16. Đặc điểm hình thái cấu trúc mô vết thương tại các thời điểm
Thời điểm
Đặc điểm hình thái mô
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30)
Trƣớc ghép
Bề mặt tổn thƣơng không có hoại tử, đƣợc phủ lớp tơ huyết mỏng.
Mô phía dƣới có ít dịch phù xen kẽ ít tế bào viêm chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính, rải rác các đại thực bào và nguyên bào sợi.
Bề mặt tổn thƣơng không có hoại tử, đƣợc phủ lớp tơ huyết mỏng.
Mô phía dƣới có ít dịch phù xen kẽ ít tế bào viêm chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính, rải rác các đại thực bào và nguyên bào sợi.
Ngày thứ 5
Mô liên kết mỏng, có ít tế bào viêm, nhiều nguyên bào sợi và tân mạch, không có ít dịch phù viêm
Mô liên kết dày, nhiều tế bào viêm, nguyên bào sợi và tân mạch, còn phù viêm nhẹ
Ngày thứ 10
Mô liên kết rất ít tế bào viêm, ít nguyên bào sợi và tân mạch Có 20/30 vết thƣơng đã đƣợc che phủ bởi lớp biểu bì mỏng nhƣng chƣa đủ 4 lớp.
Lớp tế bào biểu bì liên kết chặt chẽ với chân bì, lớp tế bào mầm tăng phân chia
Mô liên kết còn nhiều tế bào viêm nhƣng ít hơn trƣớc, không còn phù viêm, nhiều nguyên bào sợi và tân mạch. Có 16/30 vết thƣơng đã có biểu bì che phủ, có sự phân chia của tế bào lớp mầm.
Bảng 3.17. Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng tế bào viêm/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P D0 30,16 7,41 31,46 5,98 0,375
D5 18,86 4,46 18,01 5,08 0,475
D10 08,96 1,80 12,50 3,01 0,001 Số lƣợng tế bào viêm cả 2 vùng đều giảm theo tiến trình nghiên cứu. Tại thời điểm 10 ngày nghiên cứu (15 ngày sau gây bỏng), vùng A có số lƣợng tế bào viêm thấp hơn so với vùng B và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,001).
Bảng 3.18. Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P D0 13,86 5,40 13,53 03,13 0,714
D5 37,20 8,26 36,56 9,35 0,76
D10 67,10 9,09 52,73 10,38 <0,001
Số lƣợng nguyên bào sợi ở cả vùng nghiên cứu ghép tế tấm trung bì và vùng đối chứng tăng lên dần trong 10 ngày nghiên cứu và tăng cao vào ngày thứ 10. So sánh tại các thời điểm trƣớc nghiên cứu ghép tế bào, ngày thứ 5