3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.3. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây
mạ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, thực vật phải thưởng xuyên có những phản ứng thích nghi với môi trường sống thay đổi. Một trong những phản ứng thích nghi tích cực trước các yếu tố bất lợi là sự biến động mạnh một số chất tan trong tế bào liên quan đến tăng áp suất thẩm thấu (đường khử, protein tan, các axit amin tự do...). Trong các chất liên quan đến sự gia tăng áp suất thẩm thấu thì proline đóng vai trò quan trọng và rất được quan tâm nghiên cứu. Sự gia tăng hàm lượng proline ở thực vật nói chung và cây lúa nói riêng được xem là một chỉ tiêu để đánh giá khả năng chịu mất nước trước tác nhân gây hạn, mặn. Để tìm hiểu ảnh hưởng của NaCl đến các giống, dòng lúa chọn lọc, chúng tối phân tích hàm lượng proline.
Kết quả phân tích hàm lượng proline trong điều kiện gây mặn sinh lí ở giai đoạn mạ 3 lá xử lí bằng dung dịch NaCl 0,1M qua các ngưỡng thời gian 1, 3, 5 ngày được trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.5.
Bảng 3.10. Hàm lượng proline của các dòng lúa chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M ở giai đoạn mạ 3 lá
Dòng chọn lọc Hàm lượng proline (µM/g khối lượng tươi)
ĐC 1 ngày 3 ngày 5 ngày
CR203 1,08 2,54 4,23 5,00 R3.CR1 1,26 3,01 5,16 5,68 R3.CR3 1,54 2,89 5,02 5,16 R3.CR8 1,37 2,76 4,97 5,01 R3.CR14 1,20 2,82 4,39 4,98 R3.CR15 1,15 2,63 4,25 5,12
Số liệu ở bảng 3.10 cho thấy, có sự biến động rõ về hàm lượng proline trong cây mạ của các dòng lúa chọn lọc và có sự tăng đáng kể so với đối chứng. Thời gian xử lí càng dài thì hàm lượng proline tích lũy càng lớn. Hàm lượng proline tăng nhanh từ giai đoạn 1 đến 3 ngày xử lí NaCl 0,1M, đến giai đoạn 5 ngày tốc độ tăng proline giảm dần. Trong đó, giống gốc CR203 có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45
hàm lượng proline qua các ngưỡng thời gian thấp nhất (1,08 µM/g; 2,54 µM/g; 4,23 µM/g; 5,00 µM/g). Dòng R3.CR1 và R3.CR3 có hàm lượng proline cao nhất, cụ thể dòng R3.CR1 đạt 1,26 µM/g, 3,01 µM/g, 5,15 µM/g, 5,68 µM/g tương ứng với 0, 1, 3, 5 ngày xử lí, hàm lượng proline tương ứng của dòng R3.CR3 là 1,54 µM/g, 2,89 µM/g, 5,02 µM/g, 5,16 µM/g. Sự gia tăng hàm lượng proline có liên quan chặt chẽ đến khả năng chịu mặn của cây lúa. 2 dòng có hàm lượng tăng cao nhất là R3.CR1 và R3.CR3 cũng là những dòng chọn lọc có khả năng chịu mặn cao ở giai đoạn hạt nảy mầm.
0 1 2 3 4 5 6
ĐC 1 ngày 3 ngày 5 ngày
Ngày H àm l ư ợ ng prol ine ( µ M /g khố i lư ợ ng t ư ơ i) CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15
Hình 3.5. Hàm lượng proline của các dòng lúa chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M ở giai đoạn mạ 3 lá
Proline là một axit amin có chức năng tăng giữ nước của tế bào. Sự tích lũy hàm lượng proline có thể là phản ứng chống lại sự thiếu nước do NaCl gây ra. Ở thực vật khi bị tác động của áp suất thẩm thấu thì sự tích lũy hàm lượng proline có thể tăng từ 10 – 100 lần. NaCl 0.1M làm tăng hàm lượng proline trong cây mạ của các dòng chọn lọc chứng tỏ các dòng chọn lọc đều có khả năng chịu mặn tốt.
Dựa vào sự biến động của hàm lượng proline ở các dòng chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M có thể kết luận dòng R3.CR1 và R3.CR3 có khả năng chịu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46
mặn tốt hơn các dòng còn lại và giống gốc. Kết quả này phù hợp với đánh giá khả năng chịu mặn ở giai đoạn hạt nảy mầm ở các dòng chọn lọc.
3.3.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc qua gây hạn nhân tạo bằng xử lí NaCl 0,1M
Tính chống chịu của cây trồng nói chung và khả năng chịu mặn nói riêng là tính trạng đa gen. Vì vậy chúng tôi đã phân tích nhiều chỉ tiêu khác nhau bao gồm: tỉ lệ sống sót, tỉ lệ không ảnh hưởng và khả năng giữ nước của cây mạ ở giai đoạn 3 lá sau khi xử lí ở nồng độ NaCl 0,1M qua các ngưỡng thời gian 3, 5 ngày. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu chịu ảnh hưởng của mặn ở giai đoạn mạ 3 lá
Dòng chọn lọc Tỉ lệ không ảnh hưởng (%)
3 ngày (a) % so với ĐC 5 ngày (d) % so với ĐC
CR203 43,67 90,21 32,25 89,01 R3.CR1 62,34 93,25 48,16 93,45 R3.CR3 60,02 95,16 47,24 92,14 R3.CR8 48,19 90,89 37,92 94,43 R3.CR14 46,78 93,73 40,18 90,17 R3.CR15 50,26 94,21 39,13 91,08 Tỉ lệ sống sót (%)
3 ngày (b) % so với ĐC 5 ngày (e) % so với ĐC
CR203 60,25 82,16 46,54 77,82 R3.CR1 78,03 90,73 63,16 93,02 R3.CR3 75,12 93,07 60,22 90,17 R3.CR8 68,09 90,04 54,39 89,28 R3.CR14 70,11 91,15 47,31 87,63 R3.CR15 67,25 89,38 53,72 88,35
Khả năng giữ nước (%)
3 ngày (c) % so với ĐC 5 ngày (g) % so với ĐC
CR203 67,88 85,11 53,28 88,02 R3.CR1 85,34 93,08 68,15 95,63 R3.CR3 82,19 90,27 64,38 93,25 R3.CR8 76,93 92,16 55,90 90,19 R3.CR14 74,67 88,04 57,25 89,06 R3.CR15 78,36 93,17 60,27 90,78
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47
Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy, ở nồng độ NaCl 0,1M sau 1 ngày xử lí có ảnh hưởng tới cây mạ nhưng với mức độ thấp. Phần lớn cây mạ lá xanh, chỉ héo rất ít ở đầu lá, rễ không bị ảnh hưởng. Sau 3 ngày và 5 ngày xử lí NaCl 0,1M, giống gốc CR203 có các chỉ số về tỉ lệ sống sót, tỉ lệ không ảnh hưởng và khả năng giữ nước của cây mạ là thấp nhất, cao nhất là dòng chọn lọc R3.CR1, R3.CR3. Các dòng chọn lọc đều có các chỉ tiêu theo dõi cao hơn giống gốc. Điều này chứng tỏ các dòng chọn lọc đều có khả năng chịu mặn tốt hơn giống gốc, khả năng chịu mặn tốt nhất là dòng R3.CR1 sau đó là dòng R3.CR3, thấp nhất là giống gốc CR203.
3.3.3. Xác định chỉ số chịu mặn tƣơng đối ở mức độ cây mạ
Từ kết quả thu được ở bảng 3.12, chúng tôi xác định chỉ số chịu mặn tương đối (Sn) của các dòng chọn lọc và giống gốc ở mức độ cây mạ. Chỉ số chịu mặn tương đối càng lớn thì khả năng chịu mặn càng cao. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12 và hình 3.6. Bảng 3.12 cho thấy dòng R3.CR1 có khả năng chịu mặn tốt nhất (Sn = 27228,06), sau đó là các dòng R3.CR3, R3.CR15, R3.CR8, R3.CR14. Giống gốc CR203 có chỉ số chịu hạn tương đối thấp nhất đạt 15217,32.
Khả năng chịu mặn của các giống còn được biểu hiện bằng đồ thị rada 6 chiều liên quan đến các tính trạng nghiên cứu ở các ngưỡng thời gian xử lí NaCl 0,1M là 3 ngày và 5 ngày. Giữa khả năng chịu mặn và hàm lượng proline có mối tương quan thuận chặt chẽ. Hàm lượng proline càng cao thì khả năng chịu mặn càng tốt và ngược lại. Giống gốc CR203 có hàm lượng proline thấp nhất đạt 1,08 µM/g; 2,54 µM/g; 4,23 µM/g; 5,00 µM/g qua các ngưỡng thời gian theo dõi 0, 1, 3, 5 ngày xử lí cũng là giống có chỉ số chịu mặn tương đối ở giai đoạn mạ thấp nhất. Ngược lại, 2 dòng R3.CR1, R3.CR3 có hàm lượng proline cao nhất cũng là các dòng chọn lọc có chỉ số chịu mặn tương đối ở giai đoạn mạ 3 lá cao nhất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48
Bảng 3.12. Chỉ số chịu mặn tương đối của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây mạ
Dòng chọn lọc Chỉ số chịu mặn tương đối (Sn) Thứ tự
CR203 15217,32 6 R3.CR1 27228,06 1 R3.CR3 25151,31 2 R3.CR8 19233,3 4 R3.CR14 18802,67 5 R3.CR15 20084,86 3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 a b c d e g CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15
Hình 3.6. Khả năng chịu mặn của các dòng lúa chọn lọc
3.3.4. Nhận xét về khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây mạ
- Dưới tác dụng của NaCl 0,1M ở giai đoạn cây mạ 3 lá cho thấy, các dòng chọn đều có hàm lượng proline cao hơn giống gốc và đối chứng. Trong đó 2 dòng R3.CR1, R3.CR3 có hàm lượng proline cao nhất qua các ngưỡng thời gian xử lí, giống gốc CR203 có hàm lượng proline thấp nhất.
- Tiến hành xử lí NaCl 0,1M ở giai đoạn mạ 3 lá cho thấy, R3.CR1 có chỉ số chịu mặn tương đối cao nhất (Sn = 27228,06), thấp nhất là giống gốc CR203 (Sn = 15217,32).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49
- Sự gia tăng hàm lượng proline có mối tương quan thuận với chỉ số chịu mặn tương đối của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây mạ.
- Khả năng chịu mặn của các đối tượng nghiên cứu ở giai đoạn cây mạ 3 lá được sắp xếp theo thứ tự sau: R3.CR1 > R3.CR3 > R3.CR15 > R3.CR8 > R3.CR14 > CR203.
3.4. Đánh giá sự thay đổi ADN hệ gen của một số dòng lúa chọn lọc qua xử lí chịu mặn.
Trong những năm gần đây, các kỹ thuật sinh học hiện đại đã và đang được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực đặc biệt là phân tích và đánh giá hệ gen của thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử, sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống, đánh giá sự đa dạng di truyền giữa các loài và các dòng... [3], [6], [10]. Sự ra đời và phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại là những công cụ đắc lực, được áp dụng rộng rãi và hiệu quả trong chọn, tạo giống cây trồng.
Qua theo dõi đặc điểm nông học, phân tích hóa sinh và đánh giá khả năng chịu mặn ở giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn mạ 3 lá, chúng tôi chọn lọc được 5 dòng lúa từ giống gốc là CR203 qua xử lí chịu mặn bằng dung dịch NaCl 0,1M. Đây là các dòng lúa có đặc điểm nông học sai khác và vượt trội so với giống gốc đặc biệt là các chỉ tiêu về năng suất như chiều dài bông, số hạt chắc/bông, kích thước hạt..., có thời gian sinh trưởng ngắn hơn giống gốc. Những dòng này được phân tích đặc điểm hệ gen bằng kỹ thuật RAPD, làm cơ sở cho các nghiên cứu chọn lọc và khảo nghiệm giống tiếp theo.
3.4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số
ADN được tách chiết từ mầm, lá lúa các dòng chọn lọc và giống gốc được kiểm tra hàm lượng và độ tinh sạch bằng cách đo phổ hấp thụ ở các bước sóng 260nm, 280nm trên máy quang phổ, kết quả được thể hiện ở bảng 3.13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50
Bảng 3.13. Độ tinh sạch và hàm lượng ADN của các dòng lúa chọn lọc
STT Tên mẫu Tỉ số OD 260/280 Hàm lượng ADN (ng/µl) 1 CR203 1,80 2855 2 R3.CR1 1,86 3150 3 R3.CR3 1,87 3174 4 R3.CR8 1,90 2863 5 R3.CR14 1,85 3521 6 R3.CR15 1,96 3187
Bảng 3.13 cho thấy tỷ lệ OD260/OD280 dao động từ 1,80 – 1,96, hàm
lượng ADN dao động trong khoảng từ 2863 ng/µl – 3521 ng/µl. Điều này khẳng định các mẫu ADN tách chiết có độ sạch và hàm lượng cao.
CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15
Hình 3.7. Kết quả điện di ADN tổng số tách từ dòng lúa chọn lọc
Ngoài ra, ADN tách chiết từ các dòng lúa chọn lọc qua xử lí chịu mặn bằng NaCl 0,1M còn được điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di cho thấy, các mẫu ADN tách chiết từ lá lúa cho một băng duy nhất, sắc nét, gọn, có phân tử lượng cao, ở gần giếng tra. Điều đó chứng tỏ ADN thu được không lẫn tạp và đứt gãy, đủ điều kiện để tiến hành phản ứng RAPD.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51
3.4.2 Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD
Sau khi tách chiết ADN tổng số,chúng tôi pha loãng ADN về nồng độ 50 ng/µl và thực hiện phản ứng RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotit. Kết quả cho thấy cả 10 mồi đều biểu hiện đa hình.
3.4.2.1. Số phân đoạn xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN đƣợc nhân bản
Sản phẩm của phản ứng RAPD với 10 mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,5% để phân tích đa hình của 6 dòng lúa chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo qua xử lí chịu mặn ở thế hệ R3.
Kết quả thống kê số băng điện di xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD được trình bày trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản từ hệ gen của các dòng lúa chọn lọc khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên
Mồi CR203 R3.CR1 R3.CR3 R3.CR8 R3.CR14 R3.CR15 Tổng M1 6 6 6 7 4 6 35 M2 6 4 5 5 3 5 28 M3 4 6 4 5 4 5 28 M4 4 4 4 6 4 4 26 M6 4 3 5 4 6 4 26 M7 6 7 6 5 4 6 34 M8 3 3 3 4 4 5 22 M10 4 6 5 4 4 5 29 M11 8 6 4 5 3 5 31 M14 3 4 3 3 4 4 21 Tổng 48 49 45 48 40 50 280
Từ bảng 3.14 cho thấy, số lượng các phân đoạn ADN được nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 21 – 35 đoạn. Kích thước các phân đoạn ADN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52
được nhân bản trong khoảng từ 0,1 – 2,5 kb. Tổng số các phân đoạn ADN được nhân bản của 10 mồi RAPD khi phân tích 6 mẫu lúa nghiên cứu là 280. Trong 10 mồi phân tích, số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lúa ở mồi M1 là nhiều nhất với 35 phân đoạn ADN, ít nhất là mồi M14 (21 phân đoạn). Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của các dòng lúa chọn lọc khi sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích có biến động không lớn, dao động từ 40 – 50 phân đoạn. Trong đó nhiều nhất là dòng R3.CR15 có 50 phân đoạn ADN và ít nhất là dòng R3.CR14 có 40 phân đoạn ADN được nhân bản.
Tính đa hình được thể hiện ở sự sai khác về các phân đoạn ADN có xuất hiện hay không khi so sánh giữa các mẫu điện di sản phẩm RAPD của 6 dòng lúa nghiên cứu với nhau trên cùng một mồi. Điều này được tổng kết và thể hiện qua tỉ lệ phân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu. Kết quả phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên
Mồi Số phân đoạn
ADN
Số phân đoạn đa hình
Số phân đoạn đơn hình
Phân đoạn đa hình/ tổng phân đoạn (%) M1 7 3 4 42,85 M2 6 2 4 33,33 M3 6 3 3 50,00 M4 6 3 3 50,00 M6 6 2 4 33,33 M7 7 3 4 42,85 M8 5 2 3 40,00 M10 6 3 3 50,00 M11 8 4 4 50,00 M14 4 1 3 25,00 Tổng 61 26 35 42,62
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53
Kết quả tổng hợp bảng 3.15 cho thấy tổng số phân đoạn ADN của 6 mẫu lúa khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên là 61 phân đoạn, trong đó có 26 phân đoạn cho tính đa hình, chiếm 42,62% và số phân đoạn không đa hình là 35 chiếm 57,38%. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng từ 4 – 8, trong đó mồi M11 nhân được nhiều nhất là 8 phân đoạn. 2 mồi M1, M7 đều nhân được 7 phân đoạn. Số phân đoạn ADN được nhân lên thấp nhất ở mồi M14 (5 phân đoạn), các mồi còn lại đều nhân được 6 phân đoạn