Những nghiên cứu khả năng diệt trứng sán bằng các phương pháp xử lý

L ỜI CẢM ƠN

2.6. Những nghiên cứu khả năng diệt trứng sán bằng các phương pháp xử lý

lý phân gia súc

Ở nước ngoài:

Theo nghiên cứu của Maxicova ở Liên xô(cũ) (1940), về sử dụng nhiệt khắ ựể diệt trứng giun sán ở phân lợn. Cho thấy, phun nhiệt khắ ở 1700C vào phân và chuồng lợn thì chỉ sau 10 ựến 30 giây trứng giun ựũa ựã chết.

Tại Việt Nam:

Ở Việt Nam Nguyễn Thị Hoa Lý, 1998 cho biết, khi nghiên cứu hầm ủ

khắ sinh học: ở ựiều kiện kỵ khắ hoàn toàn thì số lượng trứng ký sinh trùng giảm ựi 95,6 - 96,5% so với ban ựầu, trứng còn tồn tại cũng sẽ mất hoặc giảm khả năng gây bệnh. Trong ựiều kiện Biogas hoạt ựộng pH = 6,5 - 7,5 và nhiệt

ựộ là 25 - 30oC thì sau 70 ngày lên men, 99% trứng giun sán bị tiêu diệt. Theo nhận xét của Phan Thế Việt và cộng sự (1997) nhận xét Phan Thế

Việt và cộng sự, diệt mầm bệnh dựa trên nguyên tắc ủ kắn thì nhiệt ựộ trong

ựống phân ủ tăng hơn phắa bên ngoài 6oC. Sau 2 tháng trứng giun sán bị tiêu diệt, trứng giun ựũa có thể tồn tại trong ựất khi ựược thải ra ruộng và sau 2 tháng trứng giun ựũa mới thoái hóa 50%. Sau 4 tháng có thêm 35% trứng thoái hóạ Vậy sau 6 tháng có 85% trứng giun ựũa bị tiêu diệt. Trứng giun, sán có sức ựề kháng mạnh với một số hóa chất: foocmon 2% trứng vẫn tiếp

tục phát triển, NaOH 2%, Hypoclorit Canxi 10% vẫn không diệt ựược trứng. Vào mùa hè ánh nắng chiếu trực tiếp lên ựất cát thì trứng chết nhanh. Oxy cần cho sự phát triển của trứng, trong môi trường yếm khắ trứng không phát triển

ựược nhưng vẫn duy trì sự sống. Vì vậy, trứng sống ựược một thời gian trong nước bẩn và thiếu oxị

Nguyễn Văn Thọ, 2005 nghiên cứu sức ựề kháng của trứng sán lá ruột lợn Fasiolopsin buski ở bể Biogas chứa phân lợn. Kết quả cho thấy, trong nước thải của bể Biogas có trứng Fasciolopsis buski trứng vẫn có khả năng phát triển, trứng Fasciolopsis buski lưu 30 ngày trong bể Biogas hoàn toàn mất khả năng phát triển. Trứng không phát triển ựược khi lưu giữ 20 ngày trong bể Biogas có chế phẩm EM 1%.

Theo nghiên cứu của Xuân Nghi 1961 về phương pháp ủ hiếu khắ: tác giả nhận xét: trong ngày thứ 2 nhiệt ựộở giữa ựống phân ủ tăng lên 75oC, ẩm

ựộ 65%, nhiệt ựộ không khắ từ 16 - 24oC. Kết quả cho thấy ựến ngày thứ 4 trứng giun ựũa chết hoàn toàn. Chất ựạm trong phân chiếm tỷ lệ là trong 1g có 47% ựạm.

Bằng phương pháp ủ yếm khắ, tác dụng diệt trứng là khá cao, các loại ký sinh trùng như: giun ựũa từ 180 trứng trong 1g phân tuần lễ sụt xuống chỉ

còn 4 trứng ở tuần lễ thứ 4; giun tóc từ 17 trứng trong 1g phân chỉ còn 1 trứng

ở tuần thứ 4; giun móc sau 1 tuần không tìm thấy trứng.

Nghiên cứu về sự phân tán và khả năng phát triển một số trứng giun sán lợn trong bể Biogas cho thấy, trứng giun sán thu thập từ bể Biogas vẫn còn khả năng phát riển tới ấu trùng với tỷ lệ khá cao: Ascaris suum: 64,1%;

T.suis: 66,6% và F. buski là 54,1%. Trứng T. suis và F. buski không còn khả

năng phát triển sau khi lưu giữ trong bể 30 ngày, riêng trứng Ạ suum phải gần 50 ngày mới bị diệt (Nguyễn Văn Thọ, 2003).

Phần III

đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, THỜI GIAN, NGUYÊN LIỆU, NỘI

DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu trên phân lợn, chất xơ ựược bổ sung cỏ khô, trứng giun sán

ở lợn: giun ựũa, giun tóc, sán lá ruột.

3.2. địa ựiểm nghiên cứu

đề tài ựược thực hiện tại:

- Bệnh viện thú y, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nộị

- Phòng thắ nghiệm Ký sinh trùng, bộ môn Ký sinh trùng, khoa Thú ỵ

3.3. Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 8 năm 2011 Ờ tháng 10 năm 2012.

3.4. Nguyên liệu nghiên cứu * Nguyên liệu chắnh:

- Phân lợn sinh sản - Cọng và lá cây khô

- Trứng giun ựũa (Ạsuum), giun tóc (T.suis), sán lá ruột (F.buski), chế

phẩm sinh học.

* Dụng cụ:

Máy ly tâm, máy sấy, cân, kắnh hiển vi, máy ảnh, nhiệt kế, panh, kéo,

ống ựong, cốc ựong, bình tam giác, ựũa thủy tinh, lam kắnh, ựĩa petri, công tơ

hút, pipet, giá lọc, túi vải, dây thép, lưới, cuốc, xẻng, bình tưới, liềm cắt cỏ, dao toẦ

3.5. Nội dung nghiên cứu

o Xây dựng công thức ủ phân hiếu khắ kết hợp với cỏ khô. o Theo dõi diễn biến nhiệt ựộ của ựống phân ủ hiếu khắ.

o Theo dõi sức sống của trứng ký sinh trùng trong ựống phân ủ hiếu khắ. o đánh giá thành phần dinh dưỡng, của ựống phân ủ hiếu khắ.

3.6. Phương pháp nghiên cứu

3.6.1. Nghiên cứu tiến hành theo phương pháp thực nghiệm

Chúng tôi ựã tiến hành nghiên cứu ủ phân lợn kết hợp với cỏ khô tạị

đánh giá khả năng diệt trứng giun sán của ựống ủ hiếu khắ, bệnh viện thú y, trường đại học Nông Nghiệp Hà Nộị

3.6.2. Thiết kếựống ủ hiếu khắ phân lợn kết hợp với cỏ khô

Dựa theo nguồn tài liệu từ http://en.wikipediạorg/wiki/Compost

3.6.3. Theo dõi nhiệt ựộựống ủ: qua ựo nhiệt ựộ bằng nhiệt kế bách phân.

Ớ Cách ựo:

- Lắc nhiệt kế cho xuống ựến nhiệt ựộ thấp nhất 0C

- đưa nhiệt kế vào lớp lá cây khô ngay phắa ngoài ựống phân, ghi lại kết quả trên nhiệt kế khi giá trịổn ựịnh.

- Nông vào sâu bên trong bề mặt, cách bề mặt 30 cm và trung tâm ựống ủ

50 cm.

Ớ đo nhiệt ựộ bên ngoài ựống ủ

- điều chỉnh nhiệt kế về giá trị 0ồC, sau ựó ựo nhiệt ựộ ngoài ựống ủ.

3.6.4. đo ựộẩm ựống ủ theo phương pháp thường quỵ

Ớ Cách ựo:

- Cốc ựong: Sấy ởựiều kiện 150ồC/2h. Cân khối lượng cốc - Mẫu: Cân 100g mẫu vào cốc ựong.

Cho mẫu vào sấy ở ựiều kiện 150ồC/2h. Cân lại mẫu ta ựược khối lượng m1. Tiếp tục sấy ựến khối lượng không ựổi m.

3.6.5. Thu thập trứng giun ựũa (Ạsuum); T.suis; Fasiolopsis buski, qua phương pháp mổ tử cung giun sán trưởng thành.

để thu thập trứng một số ký sinh trùng phục vụ cho nghiên cứu, chúng tôi ựã thu thập trứng giun sán trưởng thành bằng cách mổ tử cung của giun sán ựể thu thập trứng.

- Thu thập giun trưởng thành qua phương pháp mổ khám toàn diện

ựường tiêu hóa ở lợn của Skjiabin, K.Ị

- Lấy mẫu chất chứa ựường tiêu hóa theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên ựơn: chất chứa ựược lấy ra bỏ vào khay hoặc túi bóng ựã chuẩn bị

trước, ghi ựầy ựủ các thông tin cần thiết. Chất chứa lấy xong ựược ựem kiểm tra ựể lấy giun theo phương pháp gạn rửa lắng.

- Thu thập trứng sán lá ruột lợn F.buski và giun ựũa lợn Ạ suum thông qua phương pháp mổ tử cung giun sán trưởng thành.

3.6.5.1. Phương pháp mổ tử cung và thu trứng:

* Xác ựịnh vị trắ lỗ sinh dục:

- Sán lá ruột lợn: Lỗ sinh dục ựược xác ựịnh nằm ở khoảng giữa giác miệng và giác bụng.

- Giun ựũa lợn: lỗ sinh dục ở 1/3 phắa trước cơ thể. * Phương pháp mổ:

Chúng tôi khai thác nguồn trứng từ sán trưởng thành bằng phương pháp mổ cổ tử cung: Thu thập sán trưởng thành ở ruột non lợn tiến hành mổ. Phần tử cung của sán nằm ngay sau giác miệng (chứa những trứng già).

- Dùng kéo cắt hai ựường ngang trên cơ thể: một ựường dưới giác miệng, một ựường nằm phắa dưới giác bụng, hơi lùi về phắa cuối thân ta ựược phần giữa cơ thể.

- đưa phần cơ thể này vào trong ựĩa petri, dùng kéo cắt thành những

ựoạn nhỏ hơn.

buồng trứng. Dùng kắnh hiển vi soi ựể kiểm tra mật ựộ trứng. Nếu thấy mật ựộ ắt, vẫn chưa ựủựáp ứng số lượng cần thiết cho thắ nghiệm thì phải tiếp tục dầm ựến khi ựủ thì dừng lạị Ngược lại, nếu thấy số lượng ựã ựủ thì dừng lạị

- Cho thêm 15 - 20ml nước cất vào ựĩa petri, dùng ựĩa thuỷ tinh khuấy

ựều và ựổ vào một cốc ựong thông qua một giá lọc. Giữ lại phần nước ở cốc

ựong, bỏựi phần trên giá lọc.

đem phần nước này vào ly tâm, tốc ựộ 1000 vòng/phút, sau 3 phút lấy ra gạn phần nước trong bỏ ựi và giữ lại phần ở dưới ựáy ống nghiệm, cho thêm nước cất, khuấy ựều và ựổ ra ựĩa petrị Lúc này hoàn tất việc thu trứng.

3.6.5.2. Phương pháp ựếm trứng:

*Dùng công tơ hút nước trứng ở ựĩa petri ựã ly tâm, nhỏ 1 giọt lên bề

mặt của lam kắnh. đưa lên kắnh hiển vi ựếm số lượng trứng có trong 1 giọt, dùng một công tơ hút khác, hút nước cất rửa giọt nước vừa soi xuống 1 ựĩa petri khác. Ghi lại số lượng trứng vừa ựếm ựược.

* Tiếp tục lặp lại thao tác trên ựến khi nào ựủ số lượng cần dùng thì dừng lạị

3.6.5.3. Phương pháp ựưa trứng vào ựống ủ.

* đổ nước trong ựĩa petri vào túi vải ựã ựược chuẩn bị sẵn (túi ựược gấp thành hình phễu ựểựảm bảo khi ựổ trứng tập trung ở phắa dưới ựáy phễu). Sau ựó dùng dây thép buộc chặt túi vải vào cọc trẹ

* đưa trứng vào ựống phân bằng cách dùng 1 que dài nong ựống phân bằng ựúng ựầu que và ựưa cọc tre ựã ựược buộc. 3 túi vải chứa trứng vào giữa

ựống phân.

3.6.6. đánh giá sự biến ựổi của trứng sau khi lưu giữ trong ựống ủ qua sự

biến ựổi về hình dạng, màu sắc, và biến ựổi của tế bào phôi trứng.

* Dựa vào ựường tăng nhiệt ựộ của ựống phân ựể lấy trứng ra nuôi cấy (lấy vào ngày thứ 3, ngày thứ 7, ngày thứ 28).

* Phương pháp:

- Dùng ựầu panh gạt mặt trong của túi vải xuống 1 ựĩa petri, ựồng thời dội nước cất ựể thu hết trứng có trong túị Quan sát hình thái của trứng, ựánh giá sự biến ựổi của trứng.

3.6.7. đánh giá sức sống của trứng sau khi lưu giữ trong ựống ủ

đánh giá sức sống của trứng sau khi lưu giữ trong ựống ủ bằng phương pháp nuôi trứng trong môi trường nước cất.

Phương pháp:

Sau mỗi mức thời gian, lấy trứng ra khỏi ựống ủựưa ra rửa sạch rồi quan sát dưới kắnh hiển vi xem hình thái về màu sắc và sự biến ựổi của trứng.

* Trứng bình thường:

- Sán lá ruột lợn: màu vỏ chanh, vỏ mỏng, phình rộng ở giữa, thon dần

ựều về phắa hai ựầu, ở ựầu nhỏ hơn có nắp trứng. Phôi bào bên trong phân bố ựều, xếp kắn, ranh giới giữa các phôi bào không rõ ràng.

- Giun ựũa lợn: vỏ dày gồm 4 lớp, lớp vỏ ngoài màu vàng sẫm, xù xì gợn sóng.

* Trứng ựang phát triển: tế bào phôi ựang phân chia, trứng hình hành

ấu trùng.

* Trứng bị chết: tế bào phôi không phát triển hoặc trứng bị vỡ. 3.6.8.Phân tắch các chỉ tiêu chất lượng phân ủ qua phương pháp ủ phân lợn hiếu khắ không bổ sung EM và có bổ sung.

Phương pháp: phương pháp phân tắch thường quị

3.6.8. Kiếm tra chất lượng của ựộng phân ủ

- Kiếm tra chất lượng ựống ủ qua phân tắch hàm lượng N, P2O5 và K.

3.6.9. Bố trắ thắ nghiệm

3.6.9.1. Thắ nghiệm 1: xây dựng ựống ủ phân hiếu khắ

Thắ nghiệm ựược bố trắ tại bệnh viện Thú y, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nộị

Lượng phân 1 ựống ủ: 80kg Lượng cọng và lá cây khô: 20 kg

đánh ựống phân ủ theo phương pháp tạo ựống phân ủ. Thắ nghiệm ựược tiến hành trên 2 công thức:

Công thức 1: ựống phân ủ không bổ sung chế phẩm vi sinh vật học. Cách làm như sau:

- Chọn ựịa ựiểm ngoài trời là bãi ựất bằng phẳng, xây dựng ựống ủ

bằng phân lợn nái kết hợp với cỏ khô. - Cách tiến hành:

Dùng lớp cỏ khô ựã băm nhỏ khoảng 10cm, trải lên ựó một lớp phân 10 cm, dùng dụng cụ trộn ựều, tưới nước ựể có ựộẩm khoảng 40% - 60%, cứ làm như vậy tới khi tạo ra ựống phân hình khối chóp cao 1m, diện tắch ựáy 1m, bên ngoài ựống phân ựược phủ một lớp lưới ựểổn ựịnh về

mặt của ựống ủ.

Công thức 2: ựống phân ủ có bổ sung chế phẩm vi sinh vật học xử lý rác thải chăn nuôi ỘBacillỢ do Bộ môn Thú y công ựồng, khoa Thú y,

đại học Nông Nghiệp Hà Nội cung cấp.

- Cách tiến hành: giống ựống phân thứ nhất, nhưng nước ựể tạo ựộ ẩm có pha chế phẩm sinh học theo tỷ lệ 0,03%.

Các chỉ tiêu theo dõi của thắ nghiệm 1 gồm: - Diễn biến nhiệt ựộ của ựống phân ủ:

Mỗi ngày ựo nhiệt ựộ của ựống phân ủ 2 lần vào 9h sáng và 15h chiềụ

Vị trắ ựo: ựo ở 3 vị trắ, bề mặt ựống ủ và cách bề mặt ựống ủ 30 cm và trung tâm ựống ủ 50 cm. đo liên tục trong 30 ngàỵ

Lấy mẫu phân ựểựo ẩm ựộ vào thời ựiểm: ngay sau khi tạo ựống phân ủ, ngày thứ 3, ngày thứ 8, ngày thứ 14 và ngày thứ 28 sau khi ủ.

Số lần ựo: 4 lần

Các chỉ tiêu theo dõi: nhiệt ựộ và ẩm ựộ.

3.6.9.2. Thắ nghiệm 2: đánh giá sức sống của trứng kắ sinh trùng trong ựống phân ủ hiếu khắ.

Cách tiến hành như sau:

Bước 1: thu thập trứng giun sán chủ yếu ở ựường tiêu hóa của lợn là trứng giun ựũa (Ạ suum), T. suis và F. Buskị

Bước 2: ựưa trứng giun sán vào ựống ủ

Bước 3: lấy trứng ra làm sạch trứng, quan sát sự biến ựổi của trứng theo các mốc thời gian giữ trong ựống ủ sau 3 ngày, 8 ngày và 28 ngàỵ

3.6.9.3. Thắ nghiệm 3: Tìm hiểu sự phát triển của trứng sán lá ruột lợn F.buski và giun ựũa lợn Ạ suum trong ựống phân ủ hiếu khắ

Trứng sán lá ruột lợn, giun ựũa, giun tóc lợn ựược ựưa vào ựống phân ủ

ngay sau khi tạo thành ựống ủ với số lượng 3 túi trứng ựể theo dõi qua 3 mốc thời gian: sau 3 ngày, 8 ngày và 28 ngàỵ.

Ở mỗi mốc thời gian lấy ra một túi trứng làm sạch trong nước cất, quan sát trứng dưới kắnh hiển vị

Nuôi trứng có ựối chứng trong môi trường nước cất và nhiệt ựộ phòng thắ nghiệm. Thời gian nuôi là 20 ngày ựối với sán lá ruột lợn F. buski, 30 ngày

ựối với giun ựũa lợn Ạ suum.

Chỉ tiêu theo dõi: hình thái, màu sắc, sự phát triển của tế bào phôi trứng.

3.6.10. đánh giá chất lượng của ựống ủ sau 30 ngàỵ

- Hàm lượng ựạm (N) lân (P2O5) và Kali (K) ựược phân tắch tại phòng thắ nghiệm Bộ môn Nông hóa thổ nhưỡng khoa Tài Nguyên và môi trường, trường đại học Nông nghiệp Hà Nộị

- Xác ựịnh hàm lượng ựạm, lân, kali bằng phương pháp: