Các số liệu thu đƣợc sẽ đƣợc phân tích bằng cách sử dụng ANOVA một nhân tố (P < 0,05) từ chƣơng trình SPSS 13.0 và chƣơng trình Microsoft Excel.
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả miễn dịch tôm sú cảm nhiễm với Decis và WSSV 4.1.1 Kết quả của quá trình gây cảm nhiễm
Tôm sú gây cảm nhiễm đƣợc thu mẫu lúc 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ, máu tôm đƣợc sử dụng cho việc phân tích các chỉ tiêu miễn dịch, phần đầu tôm đƣợc cố định trong Davidson’ AFA để phân tích mô. Đến khoảng 54 giờ sau khi gây cảm nhiễm tôm đồng loạt chết ở các nghiệm thức I, II, III và IV. Nghiệm thức IV chỉ tiêm WSSV chết hoàn toàn, nghiệm thức I, II, III còn sống vài con, trong khi đó nghiệm thức đối chứng chỉ chết 1 con (Phụ luc C, bảng 2). Vấn đề tôm chết đồng loạt nguyên nhân có thể là do tiêm WSSV vào cơ thể tôm với nồng độ không phù hợp, vƣợt quá khả năng chịu đựng của tôm, gây sốc tôm.
4.1.2 Kết quả các chỉ tiêu miễn dịch của tôm với Decis và WSSV 4.1.2.1 Tổng bạch cầu. 4.1.2.1 Tổng bạch cầu. x10^2 tb/ml 0,000 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 300,000 0h 24h 48h
Ngày thu mẫu
T ế b à o b ạ c h c ầ u Đối chứng Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4
Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lƣợng tổng bạch của tôm sú giữa các nghiệm thức và các ngày thu mẫu
Kết quả phân tích ANOVA tổng bạch cầu cho thấy mẫu thu lúc 0 giờ, 24 giờ và nghiệm thức đối chứng 48 giờ không có sự khác biệt nhƣng lại có sự khác biệt ở nghiệm thức I, II, II, IV lúc 48 giờ (hình 4.1). Theo Söderhäll và Cerenius (1992) trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của giáp xác, bạch cầu đƣợc sinh ra có khả năng thực bào, phong tỏa melanin hóa và độc tế bào khi có tác nhân gây bệnh xâm nhập. Kết quả phân tích tổng bạch cầu cho thấy sau khi bỏ Decis vào thí nghiệm sau 24 giờ, tôm không có sự thay đổi nhiều về số lƣợng bạch cầu sản sinh ra để đáp ứng với
Decis. Trong khi đó lƣợng bạch cầu ở 48 giờ có tiêm WSSV lại giảm có khác biệt, theo Sarathi et al (2008) thí nghiệm trên tôm càng xanh có tiêm WSSV cho kết quả tế bào máu giảm đột ngột sau 1 ngày tiêm sau đó lại tăng bình thƣờng. Ở thí nghiệm này bạch cầu của tôm cũng có biểu hiện giảm đột ngột sau 1 ngày tiêm nhƣng lại chết khi chƣa tới 72 giờ nên chƣa chứng minh đƣợc bạch cầu của tôm sú có thể tăng trở lại để đáp ứng với WSSV hay không.
4.1.2.2 Hoạt tính của Respiratory burst (RES)
Hình 4.2 Biểu đồ so sánh hoạt tính Respiratory burst của tôm sú giữa các nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu
Bạch cầu của giáp xác có khả năng sản xuất ra các hợp chất oxy hóa có tác dụng kháng khuẩn nhƣ superoxide anion, oxit nitric, peroxynitrite (trích dẫn từ Lê Hữu Thôi, 2011) ), đây là loại đáp ứng miễn dịch diễn ra nhanh chóng và thoáng qua. Theo kết quả phân tích ANOVA (phụ luc D2) cho thấy nồng độ của RES lúc 0 giờ so với các nghiệm thức đối chứng khác biệt không có ý nghĩa, nồng độ RES ở các nghiệm thức I, II, III, IV tăng dần qua 24 giờ và 48 giờ (hình 4.2). Nồng độ RES tăng có ý nghĩa (P < 0,05) tại 48 giờ ở tất cả nghiệm thức có tiêm WSSV. Sự gia tăng nồng độ RES trên tôm sú sau khi tiêm WSSV cho thấy rằng bạch cầu của tôm đã giải phóng ra gốc oxy tự do để chống lại virus vì nồng độ RES do bạch cầu giải phóng ra cùng với H2O2 là hai loại oxy có khả năng đề kháng bệnh
4.1.2.3 Hoạt tính của Superoxide dismutase (SOD)
Việc sản sinh ra quá nhiều superoxide anion sẽ gây độc cho tế bào. SOD là một trong những cơ chế đáp ứng miễn dịch chính chống lại sự sốc oxy hóa trong đáp ứng oxy hóa, sốc oxy hóa tạo ra do sự mất cân bằng của các hợp chất trung gian của oxy phản ứng.
OD 630nm 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0h 24h 48h
Giờ thu mẫu
H oạ t tí nh R E S Đối chứng Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4
Trong khi nồng độ RES gia tăng dần qua các ngày thu mẫu thì kết quả phân tích ANOVA (phụ lục D3) nồng độ SOD lúc 0 giờ với các nghiệm thức đối chứng qua các ngày khác biệt không có ý nghĩa, nồng độ SOD ở các bể có nồng độ Decis khác nhau tăng có ý nghĩa (P < 0,05) ở 24 giờ, sau đó giảm ở 48 giờ sau khi tiêm WSSV tại các nghiệm thức I, II, III riêng nghiệm thức IV chỉ tiêm WSSV thì nồng độ SOD tăng dần từ 0 giờ đến 48 giờ (hình 4.3) và khác biệt có ý nghĩa lúc 48 giờ so với 0 giờ.
Hình 4.3 Biểu đồ so sánh hoạt tính s uperoxide dismutase của tôm càng xanh giữa các nghiệm thức và giữa các ngày thu mẫu
4.1.2.4 Hoạt tính của Phenoloxidase (PO)
Vai trò của hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase kích thích các phản ứng bảo vệ tế bào bao gồm cả thực bào, hình thành hạch, phong tỏa và vận động bạch cầu (Johanson et al., 2000).
Kết quả phân tích ANOVA (phụ lục D4) cho thấy hàm lƣợng PO lúc 0 giờ so với các nghiệm thức đối chứng qua các ngày không có sự khác biệt có ý nghĩa. Hàm lƣợng PO tăng cao ở các nghiệm thức có Decis lúc 24 giờ, qua 48 giờ hàm lƣợng PO giảm xuống có ý nghĩa (P < 0,05) thấp hơn giá trị lúc 0 giờ (hình 4.4). Theo Söderhäll và Cerenius (1992) chức năng của bạch cầu có hạt là hoạt hóa hệ thống phenoloxidase, vì vậy hàm lƣợng PO giảm xuống thấp sau khi tiêm WSSV có thể là do lƣợng tổng bạch cầu ban đầu giảm, khả năng giải phóng prophenoloxidase thấp, làm giảm khả năng đáp ứng bảo vệ tế bào. OD 560 nm 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 0h 24h 48h
Giờ thu mẫu
H oạ t tí nh S O D Đối chứng Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4
OD 490 nm 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0h 24h 48h
Giờ thu mẫu
H oạ t tí nh PO Đối chứng Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4
Hình 4.4 Biểu đồ so sánh hoạt tính Phenloloxidase của tôm sú giữa các nghiệm thức và các ngày thu mẫu.
4.2 Kết quả mô bệnh học của tôm cảm nhiễm với Decis và WSSV. 4.2.1 Đặc điểm mô học cơ quan gan tụy của tôm 4.2.1 Đặc điểm mô học cơ quan gan tụy của tôm
Gan tụy nằm ở phần đầu cơ thể, có dạng hình khối, có nhiều ống nhỏ hay còn gọi là ống tiểu quản kết lại rồi tập trung ở thành ống đổ vào ruột giữa. Tuyến gan tụy giữ vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa, tiết ra dịch tiêu hóa biến thức ăn thành nhủ tƣơng, đồng thời cũng có chức năng hấp thụ thức ăn (Trích dẫn theo Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003).
Quan sát tiêu bản mẫu mô tôm sú ở mặt cắt ngang của cơ quan gan tụy (hình 4.5) thì thấy gan tụy có nhiều ống nhỏ, trong mỗi ống đều có xoang dạng “hình sao”. Trên ống tiểu quản gan tụy có rất nhiều không bào lớn (tế bào B) và có nhiều tế bào máu bao xung quang ống tiểu quản.
Hình 4.5 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm sú bình thƣờng ở mặt cắt ngang (H&E) Mẫu nghiệm thức đối chứng
A: Ống tiểu quản gan tụy ( ) (10X).
B: Xoang ống tiểu quản gan tụy ( ), tế bào máu ( ), tế bào B ( ) (40X)
Hình 4.6 Cấu tạo ống tiểu quản gan tụy tôm càng xanh bình thƣờng ở mặt cắt ngang. A: Ống tiểu quản gan tụy (10X).
B: Xoang ống tiểu quản gan tụy ( ), tế bào F bắt màu tím đậm ( ), (40X) Quan sát tiêu bản mô học tôm càng xanh (Hình 4.6), mẫu thu ở nghiệm thức đối chứng trong thí nghiệm cảm nhiễm với Decis và WSSV. Cơ quan gan tụy bắt màu tím của thuốc nhuộm H&E. Gan tụy có nhiều ống và mỗi ống đều có xoang, ở mặt cắt ngang của ống gan tụy có nhiều tế bào bắt màu tím đậm.
Theo Lightner và ctv (1988), gan tụy là một hệ thống dày đặc các ống nhỏ, chúng gọi là ống tiểu quản gan tụy, khoảng giữa hai ống là xoang, ở mặt cắt ngang xoang của ống tiểu quản gan tụy có dạng “hình sao”. Trong đoạn đầu của ống tế bào F (fibrillenzellen) chiếm đa số, ở cuối ống thƣờng chứa những tế bào E (embryonalzellen) hoặc những tế bào hai nhân.Càng xa đầu mút của ống càng có nhiều tế bào khác nhƣ tế bào R (restzellen) hoặc tế bào B (blasenzellen). Tế bào B bên trong chứa không bào lớn, tế bào R chứa một lƣợng lớn nội bào tƣơng thô dạng lƣới và những hạt lipid.
Theo Bhavan và Geraldine (2000), gan tụy gồm nhiều ống tiểu quản chia làm 3 phần: đoạn đầu, đoạn giữa và đoạn cuối. Các ống tiểu quản này tập trung thành ống rồi đổ vào ruột giữa. Ở mặt cắt ngang của ống tiểu quản, có các xoang mạch máu bao quanh các ống tiểu quản, bên trong có chứa các tế bào máu. Trên ống có 4 loại tế bào: tế bào E, tế bào R, tế bào F, tế bào B. Tế bào R chứa một lƣợng lớn lƣới nội chất sần sùi và các hạt lipid, trong khi đó tế bào F không có không bào và bắt màu đậm.
4.2.2 Những biến đổi mô học trên gan tụy của tôm.
Quan sát trên tất cả mẫu mô tôm sú ở nghiệm thức có nồng độ Decis cao nhất (0,1 µg/L) của 2 lần thu mẫu: sau 24 giờ và sau 48 giờ. Kết quả mô học ở lần thu mẫu sau 24 giờ cho thấy có hiện tƣợng hoại tử trên các ống tiểu quản gan tụy. Sau 48 giờ mẫu mô của cơ quan gan tụy có hiện tƣợng hoại tử nặng hơn so với 24 giờ, làm mất cấu trúc của các ống gan tụy (Hình 4.7), tại vùng ống gan tụy bị hoại tử có rất nhiều tế bào máu bao xung quanh (Hình 4.8), theo Lightner (1996) đây là sự phản ứng của cơ thể trƣớc sự xâm nhập của vật thể lạ vào bên trong cơ thể, đồng thời có sự hiện diện của thể vùi
WSSV trong các cơ quan: mang và dạ dày (Hình 4.9 A & Hình 4.9 B). Thể vùi WSSV bắt màu hồng của Eosin và cả màu tím của Hematixylin, nhƣng chủ yếu là phản ứng màu với Hematoxylin, thể vùi có tính kiềm với vùng sáng bao quanh là giai đoạn sớm của virut (Lightner, 1996).
Tƣơng tự nhƣ những biến đổi trên cơ quan gan tụy của tôm sú, quan sát tiêu bản mô bệnh học của tôm càng xanh cảm nhiễm với Decis với nồng độ 0,25 µg/L và tiêm 0,1 ml WSSV sau 24 giờ, kết quả cho thấy ống gan tụy bị hoại tử (Hình 4.10), bên cạnh đó mang của tôm càng xanh có hiện tƣợng sƣng phồng (Hình 4.11). Theo Lightner (1996), khi mang tôm bị nhiễm vi rút đốm trắng ngoài biểu hiện đặc trƣng là tạo thể vùi trong nhân phì đại của tế bào mô mang thì còn có những biểu hiện khác nhƣ sợi mang bị teo lại, hoại tử mang, làm giãn nở hoặc làm vỡ các động mạch và tạo nhiều không bào trên mô mang.
Hình 4.7 Cơ quan gan tụy tôm sú bị hoại tử mất cấu trúc ( ) (10X) A: Gan tụy bị hoại tử nhẹ (mẫu thu lúc 24giờ, NT III)
B: Gan tụy bị hoại tử nặng (mẫu thu luc 48 giờ, NT III)
Hình 4.8 Các tế bào máu bao xung quanh ống gan tụy bị hoại tử (40X) Ống gan tụy ( ), xoang mạch máu ( ), tế bào máu ( ).
Hình 4.9 Thể vùi WSSV trên tôm sú (100X) A Thể vùi WSSV trên dạ dày (mẫu thu 48 giờ, NT III)
B Thể vùi WSSV trên mang (mẫu thu 48 giờ, NT IV)
Hình 4.6
Hình 4.10 Gan tụy tôm càng xanh bị hoại tử (10X) A: Mẫu thu sau 72 giờ
B: Mẫu thu sau 48 giờ C: Mẫu thu sau 24 giờ
A B
A B
Hình 4.11 Sợi mang tôm càng xanh sƣng phồng ( ), sợi mang bình thƣờng ( )(10X) Kết quả phân tích mô học trên tôm sú, quan sát trên 18 tiêu bản mẫu mô (phụ lục E, bảng 1). Mẫu thu lúc 0 giờ và ở nghiệm thức đối chứng cho thấy cơ quan gan tụy bình thƣờng, không có dấu hiệu bệnh. Tuy nhiên mẫu thu ở nghiệm thức có nồng độ Decis cao nhất và có tiêm WSSV gan tụy có biểu hiện hoại tử, mẫu thu lúc 24 giờ gan tụy hoại tử nhẹ, không có sự hiện diện của thể vùi WSSV, mẫu thu lúc 48 giờ gan tụy tôm bị hoại tử nặng và xuất hiện thể vùi trên mang và dạ dày tôm.
Quan sát trên 19 tiêu bản mô tôm càng xanh (phụ lục E, bảng 2), kết quả cho thấy những mẫu thu ở nghiệm thức đối chứng đều cho kết quả bình thƣờng. Tất cả mẫu thu ở nghiệm thức có nồng độ Decis cao nhất và có tiêm WSSV, gan tụy đều bị hoại tử, có biểu hiện sƣng phồng ở mang.
Đặc điểm mô bệnh học chung của tôm sú và tôm càng xanh khi cảm nhiễm với Decis và WSSV là ống gan tụy đều bị hoại tử, mức độ hoại tử nặng hay nhẹ phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc. Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) phƣơng pháp mô học có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán bệnh, thể hiện mức độ tổn thƣơng của tế bào khi bị mầm bệnh tấn công, mỗi loại mô tế bào có những biểu hiện khác nhau đối với tác nhân gây bệnh. Biểu hiện của tôm sú là xuất hiện thể vùi trong nhân phì đại mang và dạ dày, trong khi đó biểu hiện của tôm càng xanh là sự sung phồng của các sợi mang.
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận
- Kết quả phân tích tổng bạch cầu cho thấy số lƣợng bạch cầu lúc 0 giờ, 24 giờ, và nghiệm thức đối chứng 48 giờ không có sự khác biệt có ý nghĩa. Các giá trị bạch cầu ở nghiệm thức I, II, III, IV giảm xuống khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) lúc 48 giờ.
- Nồng độ của RES lúc 0 giờ so với các nghiệm thức đối chứng khác biệt không có ý nghĩa, nồng độ RES ở các nghiệm thức I, II, III, IV tăng dần qua 24 giờ và 48 giờ. Nồng độ RES tăng có ý nghĩa (P < 0,05) tại 48 giờ ở tất cả nghiệm thức có tiêm WSSV.
- Nồng độ SOD ở các bể có nồng độ Decis khác nhau tăng khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) ở 24 giờ, sau đó giảm ở 48 giờ sau khi tiêm WSSV tại các nghiệm thức I, II, III riêng nghiệm thức IV chỉ tiêm WSSV thì nồng độ SOD tăng dần từ 0 giờ đến 48 giờ và khác biệt có ý nghĩa lúc 48 giờ so với 0 giờ.
- Hàm lƣợng PO lúc 0 giờ so với các nghiệm thức đối chứng qua các ngày không có sự khác biệt có ý nghĩa. Hàm lƣợng PO tăng cao ở các nghiệm thức có Decis lúc 24 giờ, qua 48 giờ hàm lƣợng PO giảm xuống khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) thấp hơn giá trị lúc 0 giờ.
- Đặc điểm mô bệnh học chung của tôm sú và tôm càng xanh khi cảm nhiễm với Decis và WSSV là ống gan tụy đều bị hoại tử. xuất hiện thể vùi trên mang và dạ dày của tôm sú, biểu hiện phồng mang trên tôm càng xanh.
5.2 Đề xuất
- Bố trí thí nghiệm nghiên cứu lại việc cảm nhiễm của tôm sú với Decis và WSSV để có thể thu mẫu đến 96 giờ nhằm xác định chính xác hơn các chỉ tiêu miễn dịch của tôm sú.
- Trƣớc khi tiến hành gây cảm nhiễm tôm sú với Decis và WSSV nên xác định trƣớc LD50 của WSSV đối với tôm sú để có thể biết đƣợc chính xác nồng độ WSSV mà tôm sú có khả năng chịu đựng khi tiêm vào cơ thể.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ABS, 2010. Tổng quan ngành thủy sản Việt Nam. Công ty cổ phần chứng khoán An Bình. 17 trang
Bhavan, S.P., P. Geraldine, 2000. Histopathology of the hepatopancreas and gills of the prawn Macrobrachium rosenbergii exposed to endosulfan. Aquaculture Toxicology 50:331-339
Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 2011. www.agroviet.gov.vn. Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, Số: 52/2011/TT-BNNPTNT.
Bùi Quang Tề & ctv, 2010. Kết quả bƣớc đầu nghiên cứu bệnh gan tụy tôm Sú nuôi ở Việt Nam và biện pháp phòng ngừa. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I.
Collins, p. and S. Cappello, 2006. Cypermethrin toxicity to aquatic life: Bioassays for the freshwater prawn Plaemonetes argentinus. 51:79-85. Công thức cấu tạo của Deltamethrin.
http://www.inchem.org/documents/pds/pds/pet_50
Cổng Thông tin điện tử tỉnh Sóc Trăng, 2011. www.soctrang.gov.vn.
Cục NTTS, 2009. Phát triển nuôi tôm bền vững tại ĐBSCL. Báo cáo tham luận
Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007. Giáo trình Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản. Khoa Thủy Sàn. Trƣờng Đại học Cần Thơ. 86 trang.
Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phƣơng, 2007. Giáo trình Miễn Dịch Học.