chất tan anthocyanin [7]
2.3.1. Phương pháp xác định khả năng kháng oxi hóa của anthocyanin Nguyên tắc phương pháp
Trong môi trường acid các chất hydroperoxit sẽ oxy hóa Fe2+ thành Fe3+. Lượng Fe3+ tạo thành sẽ tạo phức đỏ máu với ammonium thyocyanate. Mẫu thử có chất chống oxy hóa thì lượng Fe3+ sẽ ít hơn mẫu không có chất chống oxy hóa. Hoạt độ kháng oxy hóa được hiển thị bằng phần trăm (%) Fe2+ bị ức chế tạo thành Fe3+ ở mẫu thử so với mẫu trắng (không có chất chống oxy hóa).
Cơ chế của quá trình
Khi cho Fe2+ vàohỗn hợp có chứa các chất hydroperoxit, thì Fe2+ sẽ bị oxy hóa thành Fe3+ và phản ứng với NH4SCN tạo phức có màu đỏ máu:
Công thức tính phần trăm ức chế oxy hóa:
Trong đó: Hd: Phần trăm ức chế oxy hóa. Fe2+ - e + H+ Fe3+
Fe3+ + SCN- Fe(SCN)3 (màu đỏ máu)
Hd = x 100 %A0 – A1 A0
A0: Mật độ quang của mẫu trắng. A1: Mật độ quang của mẫu thử.
2.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng oxy hóa của hợp chất tan anthocyanin
2.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất màu anthocyanin đến khả năng kháng oxy hóa
Tốc độ oxy hóa của chất béo chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố. Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin đến khả năng kháng oxy hóa tiến hành thí nghiệm có nồng độ thay đổi từ 10 – 70mg/l.
a. Đối với mẫu chất chiết trong acid
- Chuẩn bị 8 bịnh định mức 100ml, trong đó có 7 bình mẫu thử và một bình mẫu trắng.
- Cho vào 7 bình mẫu thử, mỗi bình 2ml dung dịch anthocyanin chiết trong môi trường acid có nồng độ lần lượt từ 10 -70mg/l, còn bình thứ 8 cho vào 2ml nước cất (làm mẫu trắng).
- Cho tiếp vào mỗi bình trên 2,3 ml hỗn hợp Tween80 2,5% trong ethanol + 9ml đệm phosphate.
- Đậy kín, lắc đều, bọc giấy bạc để trong tủ ấm 370C. - Sau 3h lấy ra để nguội.
- Tiếp theo chuẩn bị hai cặp ống nghiệm chia thành hai hàng, 7 cặp đầu lần lượt cho 1ml dung dịch màu vừa để nguội có nồng độ lần lượt từ 10 -70 mg/l, cặp thứ 8 cho 1ml nước cất.
- 8 ống nghiệm ở hàng thứ nhất thêm vào mỗi ống nghiệm 6ml ( ethanol 75% + dung dịch HCl 35% + dung dịch FeSO4 0,02M) để làm mẫu thử.
- 8 ống nghiệm ở hàng thứ hai thêm vào mỗi ống nghiệm 6ml ( ethanol 75% + dung dịch HCl 35% + nước cất) để làm mẫu trắng.
- Sau 5 phút (khi thêm FeSO4 ) cho vào mỗi ống nghiệm 4ml dung dịch NH4SCN 6% để SCN- tạo phức với Fe3+.
- Tiến hành đo độ hấp phụ ở bước sóng 500 nm.
b. Đối với mẫu chất chiết trong môi trường trung tính
2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng oxy hóa của chất màu anthocyanin
Thời gian cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự tự oxy hóa của chất béo. Để xác định yếu tố này ảnh hưởng như thế nào đến hoạt độ kháng oxy hóa của chất màu anthocyanin, tiến hành thí nghiệm ở các mốc thời gian khác nhau với hai mẫu chiết trong hai môi trường khác nhau ở cùng nồng độ.
a. Đối với mẫu chiết trong môi trường acid
- Chuẩn bị 7 bình định mức 100ml.
- Cho vào mỗi bình 2ml chất màu anthocyanin có nồng độ C = 50mg/l.
- Các bước tiến hành tương tự như mục 2.3.2.1 chỉ thời thay đổi thời gian cho từng mẫu là: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thứ tự Thời gian (giờ)
Bình 1 2 Bình 2 2,5 Bình 3 3 Bình 4 3,5 Bình 5 4 Bình 6 4,5 Bình 7 5
Chuẩn bị mẫu trắng song song với mẫu thử, cách tiến hành tương tự như mẫu thử chỉ thay anthocyanin bằng nước cất.
b. Đối với mẫu chiết trong môi trường trung tính
Tiến hành thí nghiệm tương tự chiết mẫu trong môi trường acid
2.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng oxy hóa của chất màu anthocyanin
Nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tự oxy hóa chất béo. Để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố này đến hoạt tính kháng oxy của chất màu
anthocyanin, tiến hành thí nghiệm ở 5 nhiệt độ khác nhau
a. Đối với chất màu anthocyanin chiết trong môi trường acid
- Chuẩn bị 7 bình định mức 100ml.
- Cho vào mỗi bình 2ml chất màu anthocyanin có nồng độ 50mg/l. - Thời gian phản ứng là 3 giờ.
- Các bước tiến hành giống như mục 2.3.2.1 chỉ thay nhiệt độ phản ứng cho từng mẫu lần lượt là: 250C, 300C, 350C, 370C, 400C, 450C, 500C.
Chuẩn bị mẫu trắng song song với mẫu thử, cách tiến hành tương tự như mẫu thử chỉ thay anthocyanin bằng nước cất.
b. Đối với mẫu chiết trong môi trường trung tính
Tiến hành thí nghiệm tương tự chiết mẫu trong môi trường acid.
Phần III: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT C (mg/l) Kết quả 10 20 3 0 40 50 60 70 A0 0.159 0.15 9 0 .159 0. 159 0.15 9 0. 159 0. 159 A1 0.157 0.15 4 0 .141 0. 128 0.10 1 0. 118 0. 134 HD 1.26 3.14 1 1.32 19 .50 36.4 8 25 .78 15 .72
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin đến khả năng kháng oxy hóa của mẫu chiết trong môi trường acid [7].
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin đến khả năng kháng oxy hóa của mẫu chiết trong môi trường trung tính [7].
C (mg/l) Kết quả 10 20 30 40 50 60 70 A0 0.159 0.159 0.159 0.159 0.159 0.159 0.159 A1 0.157 0.153 0.130 0.122 0.090 0.115 0.127 HD 1.26 3.77 18.24 23.27 43.40 27.67 20.13
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin cao nhất là ở nồng độ 50 mg/l.
Trong môi trường acid khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin cao nhất là 36,48%, còn trong môi trường trung tính là 40,43%.
Hình 3.1 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin đến khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin.
a) Trong môi trường acid. b) Trong môi trường trung tính.
Hình 3.2: Đồ thị so sánh ảnh hưởng của nồng độ anthocyanin đến khả năng kháng oxy hóa của mẫu chiết trong môi trường trung tính và trong môi trường acid.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng oxy hóa của mẫu chiết trong môi trường acid [7].
τ (h) Kết quả 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 A0 0.095 0.113 0.130 0.135 0.142 0.158 0.179 A1 0.082 0.090 0.101 0.123 0.132 0.147 0.173 HD 13.68 20.35 22.31 8.89 7.04 6.96 3.35 τ (h) Kết quả 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 A0 0.095 0.113 0.130 0.135 0.142 0.158 0.179 A1 0.08 0.085 0.092 0.112 0.121 0.142 0.168 HD 15.79 24.78 29.23 17.04 14.79 10.13 6.15
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng oxy hóa của mẫu chiết trong môi trường trung tính [7].
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin cao nhất là trong 3 giờ.
Trong môi trường acid khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin cao nhất là 22,31%, còn trong môi trường trung tính là 29,23%.
Hình 3.3 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a) Trong môi trường acid. b) Trong môi trường trung tính.
Hình 3.4: Đồ thị so sánh ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin trong môi trường trung tính và trong môi trường acid.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng oxy hóa của mẫu chiết trong môi trường acid [7].
T (0C) Kết quả 25 30 35 37 40 45 50 A0 0.108 0.110 0.122 0.128 0.148 0.155 0.161 A1 0.107 0.106 0.104 0.102 0.125 0.129 0.140 HD 0.93 3.64 14.75 20.32 15.54 16.77 13.04
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng oxy hóa của mẫu chiết trong môi trường trung tính [7].
T, (0C) Kết quả 25 30 35 37 40 45 50 A0 0.108 0.110 0.122 0.128 0.148 0.155 0.161 A1 0.105 0.097 0.094 0.092 0.116 0.123 0.135 HD 2.78 11.82 22.95 28.13 21.62 20.65 16.15
Hình 3.5 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin.
a) Trong môi trường acid. b) Trong môi trường trung tính.
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin cao nhất là ở 370C.
Trong môi trường acid khả năng kháng oxy hóa của anthocyanin cao nhất là 20,32%, còn trong môi trường trung tính là 28,13%.