2.2.1. Xử lý nguyên liệu
Quả quất được mua từ vườn ở xã Tân Tịch - phường 6 Thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp. Chúng tôi tiến hành lựa chọn sơ bộ, bỏ những quả bị dập, non, lựa chọn những quả vừa chín tới da láng mịn, căng mọng. Sau đó, đem số quả quất đã lựa chọn rửa sạch, để ráo nước, bỏ cuống, bóc lấy phần múi quả và phần vỏ quả để riêng. Một kg quả quất lấy được 115g vỏ quả quất, phần vỏ xay nhuyễn để tách lấy tinh dầu và khảo sát thành phần hóa học ngoài tinh dầu. Phần ruột lấy nước dùng định tính sơ bộ thành phần hóa học của nước quả quất.
2.2.2. Xác định độ ẩm nguyên liệu
Xác định độ ẩm nguyên liệu bằng phương pháp sấy, dưới tác dụng của nhiệt làm bay hơi lượng nước trong mẫu thí nghiệm, cân mẫu trước và sau khi sấy để tính khối lượng và độ ẩm của nguyên liệu. Nhiệt độ sấy là 50 – 600C.
Độ ẩm của nguyên liệu được tính:
(%) độ ẩm = 1 2 1 m m m x 100% Trong đó:
m1: Khối lượng ban đầu (g) m2: Khối lượng sau khi sấy (g) 2.3. Ly trích tinh dầu từ vỏ quả quất
2.3.1. Chưng cất lôi cuốn hơi nước theo phương pháp đun nóng cổ điển
Cân 100 gam vỏ quả quất rồi xay nhuyễn, ngâm trong 500ml dung dịch NaCl 10% trong 3 giờ. Tỉ lệ khối lượng vỏ tươi : thể tích nước tối ưu để thu lấy tinh dầu là 1:2,5.
Sau đó đem chưng cất lôi cuốn hơi nước theo phương pháp cổ điển trong 90 phút thu lấy tinh dầu thô.
Tinh dầu thô được xử lý, tách chiết, làm khan với đietyl ete, NaCl, Na2SO4. Dịch ete được cô quay thu lấy tinh dầu.
Hình 2.1. Quy trình chưng cất lôi cuốn hơi nước theo phương pháp đun nóng cổ điển
Hình 2.2. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước theo phương pháp đun nóng cổ điển
Làm khan bằng Na2SO4 Chiết với đietyl ete Vỏ quả quất Xay nhuyễn Ngâm 3h trong dd NaCl 10% với tỉ lệ 1:2,5
Chưng cất lôi cuốn hơi nước
1,5 giờ
Ngưng tụ
Tinh dầu thô
Tinh dầu
2.3.2. Chưng cất lôi cuốn hơi nước kết hợp với chiếu xạ vi sóng
Cân 100 gam vỏ quả xay nhuyễn, sau đó đem chưng cất lôi cuốn hơi nước theo phương pháp chiếu xạ vi sóng trong 15 phút thu lấy tinh dầu thô.
Tinh dầu thô được xử lý, tách chiết, làm khan với đietyl ete, NaCl, Na2SO4. Dịch ete được cô quay thu lấy tinh dầu.
Hình 2.3. Quy trình chưng cất lôi cuốn hơi nước theo phương pháp chiếu xạ vi sóng
Hình 2. 4. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước theo phương pháp chiếu xạ vi sóng
Vỏ quả quất
Xay nhuyễn
Chưng cất bằng sự chiếu xạ vi sóng
15 phút
Ngưng tụ
Tinh dầu thô
Lắng
Làm khan bằng
Na2SO4
Chiết với
2.4. Khảo sát các chỉ số hóa lý và thành phần hóa học của tinh dầu vỏ quả quất
Sau khi thu được tinh dầu, chúng tôi đã tiến hành đo tỷ trọng, chỉ số khúc xạ, góc quay cực, độ hòa tan trong etanol, chỉ số axit.
2.4.1. Xác định tỷ trọng
Do điều kiện vật chất của phòng thí nghiệm chưa có bình tỷ trọng nên chúng tôi đã tiến hành đo tỷ trọng tinh dầu theo phương pháp thủ công.
Dùng một ống tiêm y tế (loại 1ml), trên thân ống tiêm được vạch một đường làm dấu.
Ban đầu, đem cân ống tiêm không và ghi số liệu lại (G).
Tiếp theo: Hút nước cất đến vạch (lưu ý trong ống tiêm không có bong bóng khí) đem cân và ghi lại số liệu (G1). Rồi xả bỏ nước trong ống tiêm, vẩy cho khô nước.
Cuối cùng: Hút tinh dầu khan đến vạch (lưu ý không để cho có bong bóng khí trong ống tiêm) đem cân và ghi lại số liệu (G2).
Tỷ trọng (d) được đo ở 250C được tính bằng công thức:
2 1 G G d G G Trong đó:
G: khối lượng của ống tiêm không, tính bằng gam (g).
G1: khối lượng của ống tiêm chứa nước cất, tính bằng gam (g). G2: khối lượng của ống tiêm chứa tinh dầu, tính bằng gam (g). Cứ như thế lặp lại thí nghiệm 3 lần và lấy giá trị trung bình.
1 2 3
3
d d d
d
2.4.2. Xác định độ hòa tan trong etanol
Dùng pipet (loại 1ml) hoặc ống tiêm hút chính xác 0,1ml tinh dầu vỏ quất khan vào một ống nghiệm nhỏ (ống nghiệm đã rửa sạch và dùng cồn tráng qua sau đó làm bay hơi hết cồn).
Thí nghiệm: Khảo sát độ hòa tan trong etanol 90%.
Cho etanol 90% vào buret (buret đã được rửa sạch và tráng qua etanol). Nhỏ từng giọt etanol vào ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn tinh dầu, lắc hỗn hợp khoảng 30 giây rồi để yên 1 phút. Nếu hỗn hợp tinh dầu vẫn còn đục thì cứ tiếp tục nhỏ etanol
đến khi nào được một dung dịch đồng nhất thì ngưng và ghi lại thể tích etanol đã dùng.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi lấy giá trị trung bình.
2.4.3. Xác định chỉ số axit
Lượng tinh dầu được dùng là 0,5gam tinh dầu khan. Chuẩn bị dung dịch KOH 0,1N; phenolphthalein trung tính; etanol 960.
Hút 10ml etanol vào một bình tam giác (loại 50ml), cho 0,1ml tinh dầu khan vào bình tam giác trên và lắc cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Cho thêm vào bình tam giác khoảng 10 giọt phenolphthalein trung tính.
Do thể tích dung dịch KOH dùng ít nên ở thí nghiệm này để chính xác hơn tôi dùng pipet (hoặc ống tiêm) 1ml để chuẩn độ.
Mỗi lần nhỏ một giọt KOH 0,1N vào hỗn hợp và lắc đều cho đến khi màu của hỗn hợp chuyển sang hồng bền không biến mất trong 30 giây thì ngưng, và ghi lại thể tích dung dịch KOH đã dùng.
Làm lại thí nghệm 3 lần và lấy giá trị trung bình.
2.4.4. Đo chỉ số khúc xạ
Chỉ số khúc xạ của tinh dầu vỏ quả quất được đo ở Viện Khoa học Vật liệu và Ứng dụng Thành phố Hồ Chí Minh.
2.4.5. Đo góc quay cực
Góc quay cực của tinh dầu vỏ quả quất được đo ở Viện Khoa học Vật liệu và Ứng dụng Thành phố Hồ Chí Minh.
2.4.6. Đo phổ GC-MS để xác định thành phần hóa học của tinh dầu
Thành phần hóa học có trong tinh dầu vỏ quả quất được xác định bằng cách đo phổ GC/MS ở Viện Khoa học Vật liệu và Ứng dụng ở Thành phố Hồ Chí Minh. Máy đo là Sắc kí khí – khối phổ ký liên hợp (GC – MS) Hewlett – Packard HP 6890N, cột HP – 5MS (dài 30m; đường kính cong 0,25mm; lớp phim dày 0,25 µm), liên hợp với HP 5973. khí mang He. Thư viện phổ: NIST (1998).
2.4.7. Thử hoạt tính sinh học của tinh dầu vỏ quả quất
Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được thực hiện tại Phòng Vi sinh Thực phẩm, Khoa Xét nghiệm, Viện Pasteur Tp.Hồ Chí Minh theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, đo đường kính vòng vô trùng tạo ra bởi đĩa giấy (D = 6 mm) tẩm
tinh dầu với các nồng độ thay đổi từ 100% (tinh dầu nguyên chất) đến các nồng độ pha loãng dần.
2.5. Khảo sát thành phần hóa học ngoài tinh dầu của vỏ quả quất 2.5.1. Qui trình 2.5.1. Qui trình
Ngâm trong etanol
Lọc, cô quay đuổi dung môi
n-hexan Cô kiệt
Clorofom
Cô kiệt
1. Sắc kí cột với dung môi n-hexan: axeton 2. Sắc kí lớp mỏng 3. Cô kiệt dung môi
Hình 2.5. Quy trình ly trích các hợp chất ngoài tinh dầu của vỏ quả quất 2.5.2. Thuyết minh qui trình
Vỏ quả quất xay nhuyễn đem ngâm trong dung môi eanol trong 2 tuần.Sau đó, tách lấy dịch lỏng, bỏ bã còn lại, chiết lấy dịch etanol. Dịch etanol được đem cô quay thu lấy cao etanol.
Chiết nhiều lần cao etanol với n-hexan thu được dịch n-hexan và phần không tan. Phần không tan có lẫn n-hexan được cô quay để cô đuổi dung môi và chiết tiếp với clorofom, thu lấy cao clorofom.
Tiếp theo, chúng tôi sử dụng sắc ký cột với silicagen và sắc ký lớp mỏng (bản nhôm với silicagen) với cao cloroform. Hệ dung môi được sử dụng để tiến hành sắc ký là n-hexan : axeton theo các tỉ lệ khác nhau với độ phân cực từ thấp đến cao để tách lấy các phân đoạn màu khác nhau.
Vỏ quả quất Xay nhuyễn
Cao etanol
Cao n-hexan Phần không tan
Cao clorofom Phần không tan
Phân đoạn 1 màu xanh lam
Phân đoạn 2 màu vàng
Phân đoạn 3 màu đỏ
Định tính thành phần hóa học của các phân đoạn thu được bằng các thuốc thử. Chọn lấy phân đoạn có phản ứng với thuốc thử đặc trưng xác nhận sự hiện diện của các alkaloid, glycoside và flavonoid. Chọn lấy phân đoạn có cả 3 loại chất này, chia mẫu này làm 2 phần (mẫu 1) dùng đo phổ GC-MS xác định thành phần hóa học; Một phần được đem sắc ký cột thêm lần nữa, thu lấy dịch chiết (mẫu 2).
Xác định thành phần 2 mẫu này bằng GC-MS ở Viện Khoa học vật liệu Thành phố Hồ Chí Minh.
Hình 2.6. Sắc kí cột hai mẫu vỏ quả quất dùng xác định thành phần hóa học ngoài tinh dầu.
2.6. Khảo sát thành phần hóa học của nước quả quất
Múi quả quất được vắt lấy nước thu được dịch nước quả quất, dịch nước quả quất sau khi lọc để loại bỏ hạt, chất nhày, tạp được cho thêm 300ml metanol vào 1000 ml nước quất, đem cô quay đuổi dung môi, được cao quất.
Đem cao quất chiết với clorofom thu được dịch cloroform, cô quay đuổi bớt dung môi. Sau đó đem định tính thành phần hóa học trong dịch cloroform thu được.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Độ ẩm nguyên liệu
Tiến hành xác định độ ẩm nguyên liệu, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1. Độ ẩm của vỏ quả quất
STT m1 m2 X(%)
1 100 27.80 72.20
2 100 27.30 72.70
Trung bình 72.45
Nhận xét:
Độ ẩm của vỏ quả quất tương đối cao 72.45 %, chứng tỏ vỏ quả quất chứa nhiều nước và nhiều chất dễ bay hơi.
3.2. Ly trích tinh dầu từ vỏ quả quất
3.2.1. Khối lượng và đánh giá cảm quan của tinh dầu
Sau khi nghiên cứu các điều kiện tối ưu để thu lấy tinh dầu ở các tài liệu [2], [3], [4] chúng tôi tiến hành chưng cất tinh dầu và thu được kết quả sau:
Tinh dầu vỏ quất là chất lỏng trong suốt, có màu vàng nhạt, vị cay và có mùi thơm đặc trưng rất dễ chịu, nhẹ hơn nước, tách lớp khá rõ trong nước.
Với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển, sau 3 giờ ngâm nguyên liệu trong dung dịch muối ăn 10%, thời gian chưng cất là 90 phút, từ 100g vỏ chúng tôi thu được 3,33 ml tinh dầu.
Với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước kết hợp với chiếu xạ vi sóng không cần phải ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất là 15 phút, từ 100g vỏ chúng tôi thu được 3,14 ml tinh dầu.
Nhận xét:
Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước kết hợp với chiếu xạ vi sóng thời gian chưng cất ngắn, hiệu quả ly trích gần như tương đương với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển là do dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên nhanh chóng, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra. Tinh dầu thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ.
Tuy nhiên ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng. Ngược lại các cấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (do chúng có độ phân cực kém) nên phương pháp ly trích lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng thường thích hợp cho các loại tinh dầu có thành phần phân cực nhiều.
3.2.2. Xác định một số chỉ số hóa lý của tinh dầu
Tinh dầu sau khi chưng cất, chúng tôi tiến hành xác định một số chỉ số hóa lý tại phòng thí nghiệm Hữu cơ của trường Đại học Đồng Tháp (trừ chỉ số khúc xạ đo ở Viện Khoa học Vật liệu và Ứng dụng Thành phố Hồ Chí Minh) và thu được kết quả như sau:
Bảng 3.2. Các chỉ số hóa lý của tinh dầu
Chỉ số hóa lý Tỉ trọng Chỉ số khúc xạ Góc quay cực Độ hòa tan trong etanol 90% Chỉ số axit Đun nóng cổ điển 0,8753 (g/ml) 1,47731-4772 (31,8-32,1 0C) 30 92, 8 D 1:4,572 0,5836 Chiếu xạ vi sóng 0,8736 g/ml 1,4719-1,4720 (31,5-31,7oC) 30 93, 7 D 1:4,813 0,5713 Nhận xét: - Về chỉ số khúc xạ
Chỉ số khúc xạ cao hay thấp tùy theo thành phần các chất chứa trong tinh dầu là no, không no hoặc nhân thơm. Nếu trong tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều nối đôi thì có chỉ số khúc xạ cao. Chỉ số khúc xạ bị ảnh hưởng bởi yếu tố nhiệt độ. Khi đo chỉ số khúc xạ ở những nhiệt độ khác nhau thì cho kết quả khác nhau, nhiệt độ càng lớn thì chỉ số khúc xạ biến thiên theo hướng giảm và ngược lại.
Chỉ số khúc xạ của mẫu tinh dầu vỏ quả quất theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển là 1.477. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước kết hợp với chiếu xạ vi sóng chỉ số khúc xạ của mẫu tinh dầu vỏ quả quất là 1,472 khác nhau không nhiều
Chỉ số khúc xạ của tinh dầu thu được từ hai phương pháp chưng cất đều nằm trong khoảng 1,45 – 1,56. Chỉ số khúc xạ ở mức trung bình so với khoảng giá trị
trên do trong thành phần tinh dầu có chứa một số hợp chất có nối đôi (số nối đôi không nhiều).
- Về góc quay cực
Góc quay cực (α)D của tinh dầu thể hiện khả năng hòa tan của tinh dầu trong các loại dung môi, nếu (α)D càng lớn thì có thể hòa tan tốt trong dung môi phân cực, ngược lại (α)D càng bé thì có thể hòa tan tốt trong dung môi không phân cực. Nhiệt độ ảnh hưởng tới góc quay cực, nhiệt độ khi đo góc quay cực tăng thì góc quay cực cũng tăng theo và ngược lại.
Góc quay cực của mẫu tinh dầu vỏ quả quất theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển là tương đối thấp hơn phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước kết hợp với chiếu xạ vi sóng có thể là do thành phần hóa học của tinh dầu thu được từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước kết hợp với chiếu xạ vi sóng chứa nhiều hợp chất phân cực hơn mẫu tinh dầu thu được từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển.
- Về độ hòa tan trong etanol, tỉ trọng, chỉ số axit
Độ hòa tan trong etanol, tỉ trọng, chỉ số axit của tinh dầu vỏ quả quất thu được từ hai phương pháp chưng cất khác nhau không nhiều.
Từ giá trị độ hòa tan trong etanol cho thấy, tinh dầu vỏ quả quất hòa tan tốt trong dung môi không phân cực điều này phù hợp với kết quả đo chỉ số khúc xạ và góc quay cực ở trên.
Tỷ trọng của tinh dầu vỏ quả quất trong hai phương pháp chưng cất là 0,873 – 0,875 thấp vì vậy tinh dầu nhẹ hơn nước và nổi trên mặt nước.
Chỉ số axit tính được sau khi tiến hành thí nghiệm chuẩn độ tinh dầu bằng KOH tương đối nhỏ nên tinh dầu vỏ quả quất không chứa nhiều axit béo.
3.2.3. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu vỏ quả quất
Thành phần hóa học của hai mẫu tinh dầu vỏ quả quất thu được từ hai phương pháp đun nóng cổ điển và chiếu xạ vi sóng được xác định bằng phổ GC/MS ở Viện Khoa học vật liệu TPHCM, kết quả là trong mẫu tinh dầu có chứa khoảng 29-33 chất, trong đó có một số chất là thành phần chính của tinh dầu vỏ quả quất.
Hình 3.1. Sắc kí đồ tinh dầu vỏ quả quất thu được từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước cổ điển.
Hình 3.2. Sắc kí đồ tinh dầu vỏ quả quất thu được
Bảng 3.3. Thành phần hóa học của tinh dầu vỏ quả quất qua chụp phổ GC/MS
Thời gian lưu
STT Thành phần hóa học ĐNCĐ CXVS Đun nóng cổ điển (%) Chiếu xạ vi sóng (%) 1 D - Limonene 8,836 8,763 64,712 77,28 2 Beta-Myrcene 7,435 - 9,653 -