Khi đơng lạnh hoặc giải đơng, các hiện tượng nêu trên sẽ ựe doạ sự sống của tinh trùng, nhưng khi có biện pháp chống đơng thì khả năng tồn tại của tinh trùng là thực tế. Các nhân tố sau ựây giúp tinh trùng tồn tại khi đơng lạnh hoặc giải đơng.
Thành phần của mơi trường pha lỗng
Thành phần cơ bản của mơi trường pha lỗng tinh dịch là ựường saccharide, chất đệm và lịng đỏ trứng gà. Sức sống của tinh trùng khi đơng lạnh và giải đơng khác nhau tùy theo các thành phần nàỵ
Nồng độ tối ưu của lịng đỏ trứng từ 15 ựến 20%, nếu nồng ựộ này quá thấp hoặc q cao thì khơng tốt cho tinh trùng, mặc dù lịng đỏ trứng đã bảo vệ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31 tinh trùng khơng bị tổn hại trong khi đơng lạnh. Chức năng này chủ yếu do tác ựộng của lipoprotein và lecithin trong lịng đỏ. đường sacharide đóng vai trị quan trọng trong mơi trường, do tác động đến áp suất thẩm thấu, nó có tác dụng bảo vệ tinh trùng khi ở nhiệt ựộ thấp và là nguồn năng lượng cho tinh trùng.
Những saccharide có khối lượng phân tử cao, làm cho hoạt lực của tinh trùng tốt hơn sau khi đơng lạnh và giải đơng. Các saccharide có phân tử lượng cao (tắnh theo phân tử lượng giảm dần) bao gồm: Trisaccharide, disaccharide, hexose và pentonẹ Trong số hexose thì glucose có hiệu quả nhất, cịn các chất đa đường polysaccharide thì ắt có tác dụng. Bảo vệ lạnh bằng saccharide là nhờ có nhiều nhóm hydroxy (-OH) trong cấu trúc, do đó có xu hướng hình thành liên kết hydrọ
Chất đệm có vai trị quan trọng trong duy trì màng sinh chất của tinh trùng khi đơng lạnh và khi giải đơng, trong kắch thắch trao đổi chất diễn ra bình thường ở tinh trùng sau giải đơng đồng thời duy trì sức sống của chúng. Chất ựệm phải phù hợp như là mơi trường khi đơng lạnh và phải có đặc tắnh sau:
- Duy trì mức thấp nhất về sự tổn hại cho tinh trùng do các muối gây rạ - Phải tan trong nước với hằng số phân ly điện tắch là 6-8.
- Khả năng thấm qua màng sinh chất phải thấp và có sức đề kháng mạnh với các enzymẹ đệm ion zwitter có những tắnh chất trên nên nó tốt hơn so với ựệm phosphat hoặc ựệm Natri citrat. đệm ion zwitter là Trihydroxy methylaminomethane (Tris) và N-hydroxymethyl-2- aminoethanesulfonic acid (TES) (Bùi Xuân Nguyên và cs)[13].
Bảo quản ở 50C trước khi đơng lạnh
Bảo quản ở 50C trước khi đơng lạnh sẽ tăng cường sức kháng đơng cho tinh trùng bị. Thơng thường tinh bị sau khi khai thác và ựủ tiêu chuẩn pha chế thì tiến hành xử lý gồm:
- Pha lỗng lần ựầu tinh dịch ở 370C .
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 - Pha lỗng lần hai với mơi trường có chứa glycerol.
- Cân bằng trong 2 ựến 3 giờ. - đông lạnh tinh trùng.
- Bảo quản tinh trùng ựã làm lạnh ở 50C trước khi pha lỗng lần hai đã nâng cao ựáng kể tỷ lệ sống của tinh trùng sau khi đơng lạnh và giải đơng.
Một cách khác (cách 2) của phương pháp này là bảo quản qua ựêm (từ 20 ựến 22 giờ), tinh trùng ựã làm lạnh ở 50C, trước khi pha loãng lần haị Sức sống của tinh trùng theo cách xử lý hai tốt hơn so với cách sử lý thông thường (cách 1). Cách thứ ba là bảo quản tinh trùng qua ựêm khi ựã cân bằng với glycerol trong 20 ựến 22 giờ, ở 50C sau khi pha loãng lần haị Cách hai tốt hơn nhiều so với cánh thứ ba và ựiều này thể hiện sức kháng đơng của tinh trùng có khác nhau tùy theo giai đoạn nhạy cảm với nhiệt ựộ thấp (Tsuyoshi)[29].
Nồng ựộ của glycerol và thời gian cân bằng
Nồng ựộ glycerol trong mơi trường pha lỗng cuối cùng ựể làm ựơng lạnh tinh trùng bị vào khoảng 7%, nhưng tỷ lệ này có hơi khác nhau tùy theo các thành phần của mơi trường pha lỗng. Nồng ựộ tối ưu cho sức sống của tinh trùng là 11% với sữa khử bơ. Nồng ựộ glycerol trong môi trường pha lỗng có mối tương quan ựáng tin cậy với tốc ựộ giải đơng, đó là nồng độ glycerol cao trong mơi trường pha lỗng là cần thiết cho tốc ựộ giải đơng nhanh (Hiroshi)[19].
Thời gian từ lúc bổ sung glyceryl vào mơi trường pha lỗng (pha lỗng lần hai) ựến khi bắt đầu làm đơng lạnh ựược gọi là thời gian cân bằng glycerol.
Tốc ựộ làm lạnh
Tốc ựộ làm lạnh quá nhanh sẽ gây tổn hại tới tinh trùng vì nó gây ra siêu lạnh, thể vẩn và nước lưu giữ trong tế bàọ điều đó gây ra đơng lạnh ngoại bào và sau đó đơng lạnh nội bàọ Tốc độ làm lạnh chậm sẽ gây ra tập
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 trung nồng ựộ cho cả dung dịch ngoại bào và dung dịch nội bào và sẽ làm rối loạn tế bào, ựây ựược coi là ảnh hưởng của dung dịch. Tốc ựộ làm lạnh tối ưu là tốc ựộ làm giảm tối đa cả đơng lạnh nội bào và ảnh hưởng của dung dịch.
Tốc ựộ làm lạnh tối ưu này khác nhau không chỉ theo loại tế bào mà còn theo các yếu tố như các thành phần của thể vẩn tế bào và loại chất chống đơng băng. Chẳng hạn dung dịch ựường saccharide ựược đơng lạnh nhanh (đơng lạnh từ 2 đến 4 phút, 50C xuống -790C), cho hoạt lực tinh trùng sau giải đơng cao hơn so với đơng lạnh chậm (đơng lạnh 45 phút, từ 50C xuống - 790C), vì ựã ngăn cản ựược ảnh hưởng của dung dịch. Mơi trường pha lỗng có nồng ựộ glycerol từ 5 ựến 7% ựược ựông lạnh nhanh (đơng lạnh từ 3 đến 5 phút, từ 50C xuống -1300C) cho hoạt lực tinh trùng cao hơn so với đơng lạnh chậm (đơng lạnh từ 20 đến 40 phút, từ 50C xuống -790C) (Hiroshi, 1992)[19].
Hình 2.8: Ảnh hưởng của glycerol trong dung dịch NaCl so với nồng ựộ NaCl trong dung dịch cịn lại khi dung dịch NaCl (0,15M) được đơng
lạnh (Hiroshi)[19]
Tốc ựộ giải đơng
Tốc độ giải đơng tinh đơng lạnh có ảnh hưởng lớn đến sức sống, hoạt lực, tỷ lệ acrosome bình thường và q trình trao đổi chất của tinh trùng. Giải đơng tinh cọng rạ bằng nước 350C sức sống tinh trùng cao hơn so với nước
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 40C hoặc 200C. Giải đơng ở nước từ 35 ựến 750C cũng cho tỷ lệ acrosome bình thường cao hơn so với nước 40C hoặc 200C. Nhưng nếu giải đơng bằng nước có nhiệt độ cao hơn nữa, chẳng hạn nước 900C, sẽ làm giảm sức sống của tinh trùng. Nếu tinh trùng ựược bảo quản ở nhiệt ựộ 370C sau khi giải đơng, cọng rạ nào được giải đơng nhanh ở nhiệt độ cao hơn sẽ có sức sống tinh trùng cao hơn.
Thời gian bảo quản
Tinh trùng đơng lạnh phải ln ln được bảo quản ngập chìm trong nitơ lỏng (-1960C), nếu bảo quản tốt sau vài chục năm, tỷ lệ sống và sức hoạt ựộng của tinh trùng vẫn khơng thay đổi, khả năng thụ tinh vẫn không bị giảm (Hà Văn Chiêu)[7]. Thụy Sỹ tinh bị đơng lạnh bảo quản 20 năm vẫn thụ tinh và bị mẹ đẻ bê con ngày 25-7-1975. Ở Nhật Bản tinh cọng rạ bảo quản từ 4 đến 13 năm vẫn có sức hoạt ựộng từ 45 ựến 55% và có tỷ lệ thụ tinh 54%. Có nhiều trường hợp tinh đơng lạnh bảo quản 20 năm vẫn có tỷ lệ thụ tinh là 69,8% (Hiroshi)[19].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35