4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KHÁNG THUỐC
4.3. Cỏc phương phỏp định typ theo kiểu hỡnh (phenotype) mới
Phương phỏp đũi hỏi phũng thớ nghiệm đặc trưng và thời gian đủ dài để
cú kết quả của cỏc phương phỏp cổ điển và sự cần thiết cú cỏc thiết bị đắt tiền cũng như kỹ năng kỹ thuật cỏ nhõn của hầu hết cỏc phương phỏp sinh học phõn tử đang kớch thớch sự tỡm tũi, phỏt triển cỏc phương phỏp thớch hợp trong xỏc
định tớnh khỏng thuốc của vi khuẩn lao.
Phương phỏp thực khuẩn thể
Cú hai phương phỏp sử dụng thực khuẩn thể (TKT) hiện nay đang được phỏt triển cho xỏc định nhanh tớnh khỏng thuốc của vi khuẩn gõy bệnh lao. Phương phỏp thứ nhất, là phương phỏp khuếch đại sinh học TKT của M. tuberculosis do Wilson và CS mụ tả năm 1997; và phương phỏp thứ hai dựa trờn thể hiện mycobacteriophage phỏt huỳnh quang Jacobs mụ tả năm 1993.
Phương phỏp TKT dựa trờn nguyờn tắc khuếch đại sinh học Mycobacteriaphage được ỏp dụng nhiều trong những năm gần đõy. Những phương phỏp này dựa trờn khả năng của vi khuẩn để hỗ trợ phỏt triển của TKT. Số lượng TKT nội gen đại diện cho số lượng M. tuberculosis sống cú trong bệnh phẩm, được xỏc định trong mycobacteria mọc nhanh như M.smegmatis. Thử
nghiệm khuếch đại TKT in house và kit thương mại FastPlaque TB đó được thử
nghiệm để xỏc định tớnh khỏng RMP trờn chủng phõn lập và trực tiếp trờn bệnh phẩm. Một nghiờn cứu thực hiện trờn 129 chủng phõn lập từ khu vực cú tỉ lệ
MDR-TB cao cho thấy phương phỏp khuếch đại TKT in house cú độ nhạy 100%, độđặc hiệu 97,7%, giỏ trị tiờn đoỏn 95,2% cho xỏc định nhanh chủng M. tuberculosis khỏng RMP; thử nghiệm cú thể ỏp dụng như thử nghiệm thường xuyờn của cỏc phũng thớ nghiệm chuẩn thức cú mức độ trang thiết bị bỡnh thường. Thử nghiệm FastPlaque TB được đỏnh giỏ trong một nghiờn cứu so sỏnh với phương phỏp tỉ lệ trờn mụi trường Middlebrook 7H11 trong xỏc định khỏng RMP trực tiếp trờn bệnh phẩm đơm AFB dương tớnh [22]. Nghiờn cứu cho thấy độ nhạy và độđặc hiệu đạt 100% với kết quả cú được sau hai ngày.
Phương phỏp TKT mang luciferase dựa trờn dấu hiệu ỏnh sỏng do vi khuẩn sống nhiễm TKT đặc hiệu mang gen luciferase phỏt ra. Cường độ ỏnh
sỏng phụ thuộc mức độ nhiễm TKT và mức độ biểu hiện gen luciferase và mức
độ ATP tế bào. Dấu hiệu cú thể được phỏt hiện sớm, trong vài phỳt, sau khi bị
nhiễm. Chủng M. tuberculosis nhạy cảm với INH hoặc RMP ngừng phỏt sỏng, cũn chủng khỏng tiếp tục phỏt sỏng. Thử nghiệm này được đỏnh giỏ trong nghiờn cứu tớnh khỏng 4 loại thuốc thế hệ thứ nhất với độ tương quan khoảng 98,6% so với kết quả của hệ BACTEC TB 460 [33]. Hơn nữa, trong một nghiờn cứu hiện nay sử dụng hai phương phỏp, địa quang và ỏnh sỏng, để so sỏnh và độ
nhạy trong xỏc định tớnh khỏng RMP và INH đạt 100% cho thấy 4 phương phỏp
đều thớch hợp như thử nghiệm sàng lọc đối với giỏm sỏt khỏng MDR-TB [44].
Đó cú một hệ thống đỏnh giỏ và phõn tớch kết luận về tớnh chớnh xỏc của cỏc phương phỏp TKT trong xỏc định khỏng RMP ở M. tuberculosis. Nghiờn cứu cho thấy thử nghiệm TKT trờn chủng M. tuberculosis cú độ nhạy cao, nhưng dao động và tớnh đặc hiệu thấp hơn. Chưa cú đủ bằng chứng về tớnh chớnh xỏc của thử nghiệm khi thực hiện trực tiếp trờn bệnh phẩm.
Phương phỏp so màu
Nhiều phương phỏp so màu đó được phỏt triển trong những năm gần đõy với mục đớch ứng dụng trong xỏc định nhanh tớnh khỏng thuốc của M. tuberculosis. Phương phỏp dựa trờn chỉ thị oxy húa khử (redox) hoặc muối tetrazolium để phỏt hiện sự phỏt triển của vi khuẩn. Thử nghiệm dựa trờn khả
năng giảm chỉ thị màu trong oxy húa khử bổ sung trong mụi trường chứa cỏc khỏng sinh khỏc nhau được cấy với M. tuberculosis. Tớnh khỏng thuốc được xỏc
định bằng đo sự thay đổi màu của chỉ thị tỉ lệ thuận với số lượng vi khuẩn phỏt triển được trong mụi trường.
Xanh alamar (Trek Diagnostics, Ohio, Mỹ) là loại húa chất phự hợp đầu tiờn được đưa vào sử dụng trong xỏc định tớnh khỏng thuốc ở M. tuberculosis. Húa chất cú màu xanh sẽ bị khử chuyển thành hợp chất màu hồng. Trong một nghiờn cứu Yajko (1995) đỏnh giỏ hoạt tớnh của INH, RMP, EMB và SM trờn chủng M. tuberculosis phõn lập, MIC được xỏc định sau 1-2 tuần nuụi cấy với
độ chớnh xỏc 97%, so với phương phỏp tỉ lệ trờn thạch. Xanh alamar được thử
thử nghiệm tớnh khỏng thuốc chống lao bằng hệ vi phiến. Trong những nghiờn cứu này, xanh alamar hoạt động tốt, đặc biệt trong xỏc định tớnh khỏng INH và RMP.
Muối tetrazolium 3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide hoặc MTT là hợp chất màu vàng, khi giảm nồng độ trong quỏ trỡnh chuyển húa của tế bào, sẽ tạo tinh thể MTT formazan khụng tan màu hồng, cú thể đo được bằng thiết bị đo quang phổ sau khi hũa tan. MTT cũng được đề nghị
sử dụng trong thử nghiệm đo màu phỏt hiện tớnh khỏng RMP. Phương phỏp
được thử nghiệm trờn 92 chủng M. tuberculosis lõm sàng cú kết quả tương ứng tốt với kết quả thu được bằng phương phỏp chuẩn vàng BACTEC. Mới đõy, thử
nghiệm MTT được ứng dụng trong phỏt hiện tớnh khỏng cỏc thuốc khỏc với kết quả khả quan. Với mục đớch đẩy nhanh tiến độ phỏt hiện khỏng thuốc trực tiếp từ bệnh phẩm lõm sàng, MTT đó được ứng dụng trong thử nghiệm trực tiếp với bệnh phẩm để xỏc định tớnh khỏng RMP. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương phỏp MTT trực tiếp này tương quan với kết quả thực hiện bằng cỏc phương phỏp chuẩn giỏn tiếp trờn thạch 7H10 với 98,5% bệnh phẩm cú kết quả trong vũng 2 tuần [22].
Kết quả nghiờn cứu đó xỏc nhận vai trũ của resazurin, một thành phần quan trọng của hợp chất xanh alamar. Chỉ thị oxy húa khử này cũng được sử
dụng trong thử nghiệm nhanh phỏt hiện khỏng thuốc ở M. tuberculosis. Thử
nghiệm ELISA sử dụng resazurin (REMA) cho phộp phỏt hiện nhanh chủng M. tuberculosis khỏng đa thuốc với độ chớnh xỏc 97% so với phương phỏp tỉ lệ sử
dụng mụi trường Loweinstein-Jensen. REMA cũng cú ớch trong phỏt hiện tớnh khỏng thuốc chống lao, bao gồm cả cỏc thuốc thế hệ hai như Quinolon và Pyrazinamid.
Trong một nghiờn cứu đa trung tõm, thử nghiệm REMA và MTT cú độ
nhạy và độ đặc hiệu khoảng 96% và 99% trong xỏc định tớnh khỏng của cỏc chủng M. tuberculosis mó húa đối với INH, RMP và EMB so với kết quả của phương phỏp tỉ lệ (Martin 2005b). Một nghiờn cứu xem xột đỏnh giỏ một cỏch hệ thống về phương phỏp sử dụng chỉ thị oxy húa khử so mầu cho thấy phương phỏp cú độ nhạy và độđặc hiệu cao đối với phỏt hiện MDR-TB. Phương phỏp so
mầu cú thể là khả năng thay thế tốt trong phỏt hiện nhanh tớnh khỏng thuốc ở
phũng thớ nghiệm mức độ hạn chế.
Thử nghiệm khử nitrate
Thử nghiệm khử nitrate (NRA) là kỹ thuật đơn giản dựa trờn khả năng của
M. tuberculosis khử nitrate thành nitrit, phỏt hiện được bằng húa chất cho thờm vào mụi trường. M. tuberculosis được nuụi cấy trờn mụi trường Loweinstein- Jensen trong sự cú mặt của khỏng sinh và khả năng tạo nitrit từ nitrate được đo sau 10 ngày. Chủng khỏng sẽ giảm nitrate, chuyển mụi trường sang màu hồng, chủng nhạy cảm sẽ khụng cú khả năng này vỡ bị ức chế bởi khỏng sinh. Thử
nghiệm được đỏnh giỏ trong nhiều nghiờn cứu với cỏc thuốc thế hệ thứ nhất và ofloxacin với kết quả tốt. Ưu điểm của hệ phương phỏp này là sử dụng cựng quy trỡnh và cựng mụi trường như phương phỏp tỉ lệ. Một nghiờn cứu đa trung tõm mới đõy đỏnh giỏ NRA trong phỏt hiện tớnh khỏng thuốc thế hệ thứ nhất (INH, RMP và EMB) đạt được độ chớnh xỏc 96,6% đến 98%. Đối với SM, tỉ lệ này thấp hơn. Tuy nhiờn, NRA thực hiện dễ trong điều kiện phũng thớ nghiệm đơn giản. Hai nghiờn cứu gần đõy ỏp dụng RNA trực tiếp trờn bệnh phẩm cú độ nhạy và độ đặc hiệu khỏ dao động; đối với xỏc định tớnh khỏng INH và RMP cú kết quả tốt hơn. Hai nghiờn cứu này cho thấy khả năng thực hiện NRA trực tiếp trờn mẫu đờm trong những nghiờn cứu đỏnh giỏ ở cỏc cộng đồng mục tiờu.
Thử nghiệm xỏc định tớnh nhạy cảm thuốc trong mụi trường lỏng bằng soi kớnh
Thử nghiệm quan sỏt độ nhạy cảm với thuốc của vi khuẩn bằng soi kớnh (MODS) được mụ tả cho xỏc định sớm sự phỏt triển và là phương phỏp xỏc định nhanh tớnh nạy cảm thuốc của M. tuberculosis. Phương phỏp dựa trờn việc quan sỏt hỡnh thành cord đặc trưng của M. tuberculosis trong mụi trường lỏng bằng kớnh hiển vi đảo ngược [35]. Trong nghiờn cứu này, mẫu đờm AFB dương tớnh
được nuụi cấy với mụi trường chứa khỏng sinh INH và RMP và xỏc định tớnh nhạy cảm bằng MODS. Kết quả được so sỏnh với phương phỏp so màu sử dụng xanh alamar. Tỉ lệ kết quả tương đồng giữa hai phương phỏp đạt 89% sau 9,5 ngày. Phương phỏp cú độ nhạy, độ đặc hiệu cao, giỏ thành rẻ, cú giỏ trị trong
xỏc định nhanh tớnh nhạy cảm với thuốc của M. tuberculosis, phự hợp với điều kiện của cỏc nước đang phỏt triển.
Hiện nay, trong một nghiờn cứu thực hiện ở Pờ-ru, sử dụng MODS so sỏnh với hệ nuụi cấy mycobacteria tự động và với phương phỏp tỉ lệ trờn mụi trường Lowenstein -Jensen để xỏc định tớnh khỏng INH, RMP, EMB và SM trờn mẫu đờm. Thời gian trung bỡnh cú kết quả là 7; 22 và 68 ngày đối với MODS, nuụi cấy tự động và phương phỏp tỉ lệ. Độ tương đồng giữa MODS và cỏc phương phỏp chuẩn khỏc là 97% đối với INH, 100% với RMP và 99% với cả
INH và RMP (MDR). Đối với EMB và SM, giỏ trị tương đồng thấp hơn (95% và 92%). Nghiờn cứu kết luận phương phỏp nuụi cấy MODS cú kết quả nhanh hơn và nhạy hơn trong phỏt hiện MDR-TB. Một nhược điểm nhỏ của phương phỏp là cần kớnh hiển vi soi ngược để quan sỏt sự phỏt triển của vi khuẩn.
Phương phỏp thạch lớp mỏng
Phương phỏp này cũn được gọi là phương phỏp lớp thạch mỏng 7H11 (TL7H11) hoặc vi khuẩn lạc, đó được mụ tả ở chương 14, cũng là một trong những phương phỏp xỏc định nhanh chủng khỏng đa thuốc trực tiếp trong bệnh phẩm. Phương phỏp cú độ chớnh xỏc cao qua một số nghiờn cứu ban đầu khi so sỏnh với phương phỏp cổ điển xỏc định MDR-TB, kết quả cú được sau 1 tuần.
Cỏc phương phỏp đang cần được đỏnh giỏ rộng hơn trờn cỏc cộng đồng mục tiờu bởi cỏc nhúm nghiờn cứu khỏc nhau.Tuy nhiờn cỏc kỹ thuật thử độ
nhậy của thuốc lao được thống nhất là:
• Phương phỏp nồng độ tuyệt đối (Absolute con-centration method). • Phương phỏp khỏng sinh đồ tỷ lệ (Resistancerratio method).
• Phương phỏp tỷ lệ (Proportion method). • Phương phỏp đo phúng xạ BACTEC 460.
Phải cú sự thống nhất giữa phũng xột nghiệm của chương trỡnh chống lao quốc gia với phũng xột nghiệm siờu quốc gia về kết quả khỏng của Rifampicin và Isoniazid từ 96% trở lờn.