4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KHÁNG THUỐC
4.2. Phương phỏp genotyp
Phương phỏp genotyp xỏc định tớnh khỏng thuốc trong bệnh lao gồm 2 bước cơ bản: khuếch đại axit nucleic như PCR để khuếch đại vựng gen liờn quan
đến chủng khỏng thuốc; và kiểm tra sản phẩm khuếch đại để tỡm đột biến đặc hiệu cú liờn quan đến tớnh khỏng thuốc
Xỏc định trỡnh tự ADN
Xỏc định trỡnh tự ADN của sản phẩm PCR đang trở thành phương phỏp genotyp phổ biến xỏc định chủng khỏng thuốc. Phương phỏp cho kết quả chớnh xỏc và tin cậy, trở thành phương phỏp chuẩn cho phỏt hiện đột biến. Hiện nay, phương phỏp được thực hiện với thiết bị xỏc định trỡnh tự tự động. Xỏc định trỡnh tự ADN được ứng dụng rộng rói trong xỏc định tớnh chất đột biến ở gen rpoB của chủng khỏng RMP và để phỏt hiện đột biến gõy khỏng cỏc loại thuốc khỏc. Phỏt hiện M. tuberculosis khỏng thuốc cũng được thực hiện bằng cụng nghệ pyrosequence [52]. Cụng nghệ này là kỹ thuật xỏc định trỡnh tự đọc ngắn (30-50bp), dựa trờn nguyờn tắc định lượng pyrophosphat giải phúng từ cỏc nucleotid được gắn ở chuỗi ADN phỏt triển. Tuy nhiờn khụng phải tất cả cỏc cơ
chế phõn tử của khỏng thuốc ở M. tuberculosis được biết và khú thực hiện cỏc kỹ thuật này hàng ngày do giỏ thành cao để phỏt hiện cỏc gen đột biến liờn quan
đến tớnh khỏng nhiều loại thuốc.
Kỹ thuật lai ghộp trờn phase rắn
Hiện cú hai kỹ thuật lai ghộp trờn phase rắn xỏc định tớnh khỏng thuốc của VK lao cú trờn thị trường: Thử nghiệm Line Probe (INNO-LiPA Rif TB assay, Immonogenetics, Ghent, Belgium xỏc định khỏng RMP và Genotyp MTBDR assay (Hain Lifesciences, Nehren,Germany) xỏc định khỏng INH và RMP.
Thử nghiệm LiPA được đưa vào sử dụng trong thực tế cỏch đõy vài năm, dựa trờn lai ghộp ngược đoạn ADN khuếch đại từ chủng nuụi cấy hoặc bệnh phẩm với 10 đoạn dũ (probe) phủ vựng nhõn của gen rpoB của M. tuberculosis
gắn trờn giấy nitrocellulose. Từ cỏc kiểu lai ghộp thu được, cú thể nhận biết
được sự thiếu hụt hoặc hiện diện của vựng đột biến liờn quan đến tớnh khỏng thuốc, và như vậy cú thể kết luận chủng khỏng hoặc nhạy cảm với RMP. Nhiều
nghiờn cứu đó được thực hiện dựa trờn việc ỏp dụng kỹ thuật này để xỏc định tớnh khỏng RMP; phần lớn được thực hiện trờn cỏc chủng M. tuberculosis phõn lập được và chỉ một số ớt thực hiện trực tiếp với bệnh phẩm đờm [55]. Khỏng RMP được coi là chỉ số quan trọng biểu thị dấu hiệu khỏng đa thuốc với độ nhạy
đến 98,5%. Hiện nay, cỏc nghiờn cứu hệ thống sử dụng thử nghiệm LiPA cho thấy 12/14 nghiờn cứu thực hiện trờn cỏc chủng phõn lập cú độ nhạy đạt trờn 95% và độ đặc hiệu 100%. 4 nghiờn cứu sử dụng LiPA trực tiếp trờn bệnh phẩm cú độ đặc hiệu 100%, độ nhạy dao động từ 80-100%. Trong nghiờn cứu gần đõy Traore năm 2000 sử dụng LiPA trong xỏc định chủng khỏng RMP ở 420 mẫu
đờm thu thập từ nhiều quốc gia, kết quả cú độ tương ứng 99,6% với kết quả xỏc
định khỏng thuốc bằng nuụi cấy, khẳng định tớnh hiệu quả của LiPA trong xỏc
định nhanh chủng khỏng RMP ở bệnh phẩm đờm.
Hệ Genotype MTNDR phỏt hiện tớnh khỏng với INH và RMP ở chủng nuụi cấy dựa trờn xỏc định vựng đột biến phổ biến ở gen katG và rpoB. Phương phỏp cũng sử dụng PCR và lai ghộp ngược với mồi gắn trờn thanh ADN. Một nghiờn cứu gần đõy đỏnh giỏ thử nghiệm này trờn 143 chủng M. tuberculosis
cho thấy cú 99% chủng MDR được xỏc định cú đột biến ở gen rpoB và 88,4% chủng cú đột biến ở vựng codon 315 của gen katG [49]. Mối tương quan với kết quả xỏc định trỡnh tự ADN đạt 100% với độ nhạy và độđặc hiệu cao khi so sỏnh với kết quả thu được từ cỏc phương phỏp cổ điển. Chỉ cú hai nghiờn cứu thực hiện trực tiếp với bệnh phẩm, một nghiờn cứu cho thấy cú sự tương quan đạt 100% khi so sỏnh với phương phỏp cổ điển [48], nghiờn cứu thứ hai được thực hiện trờn 143 bệnh phẩm đờm dương tớnh với AFB, kết quả cho thấy 48/57 bệnh phẩm chứa chủng khỏng INH (0,4ug/ml) cú tớnh khỏng INH (84,2%), 25/26 bệnh phẩm chứa chủng khỏng RMP (96,2%).
Cả hai phương phỏp lai ghộp trờn phase rắn đều được chứng minh dễ thực hiện, tuy nhiờn đũi hỏi cú kiến thức cơ bản về cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử và PCR. Như cỏc phương phỏp genotyp khỏc, độ nhạy của thử nghiệm phụ thuộc vào số lượng ADN hiện diện trong bệnh phẩm, và sự cú mặt của cỏc chất gõy ức chế.
Một thử nghiệm lai ghộp ngược trờn phase rắn khỏc xỏc định tớnh khỏng RMP, là rifoligotyping. Đõy là phương phỏp “in house” giỏ thành thấp dựng để
xỏc định dột biến liờn quan đến khỏng RMP ở gen rpoB của M. tuberculosis. Thử nghiệm do Viện Sức khỏe Quốc gia và Mụi trường, Hà Lan, phỏt triển và
đỏnh giỏ trờn thực địa Ác-hen-ti-na. Thử nghiệm cũng bao gồm khuếch đại ADN và lai ghộp dot blot ngược. ADN của gen rpoB, chủng M. tuberculosis
được khuếch đại bằng PCR với cỏc đoạn mồi đặc hiệu và sản phẩm PCR được lai ghộp với cỏc oligonucleotid gắn trờn màng ADN mó húa cho trỡnh tự rpoB hoang dại, và là vựng cú phần lớn cỏc đột biến liờn quan đến khỏng RMP. Sản phẩm PCR của chủng khỏng RMP sẽ khụng lai ghộp được với một hoặc nhiều oligonucleotid hoang dại, và phần lớn cỏc trường hợp sẽ lai ghộp với một trong những oligonucleotid đột biến gắn trờn màng. Chủng khỏng RMP cú thể được phỏt hiện trong vũng vài giờ nếu sử dụng phản ứng phỏt quang để kớch hoạt. Trong nghiờn cứu đỏnh giỏ này, khoảng 135 chủng M. tuberculosis được xột nghiệm với thử nghiệm rifoligotyping và kết quả xỏc định đỳng 90/97 chủng khỏng RMP (độ nhạy 92,8%) và cỏc chủng nhạy cảm RMP cũng được xỏc định chớnh xỏc. Phương phỏp rifoligotyping cú sử đổi chỳt ớt được thực hiện trong một nghiờn cứu đa phũng thớ nghiệm để xỏc định tớnh khỏng RMP, INH, SM và EMB ở cỏc chủng M. tuberculosis phõn lập được. Oligonucleotid đặc hiệu cho cỏc alen hoang dại hoặc đột biến của những codon nhất định thuộc vựng gen rpoB, ahpC, inhA, rpsL, rrs, embB được gắn lờn màng nylon. Để đỏnh giỏ, màng
được gửi đi 7 phũng thớ nghiệm thuộc cỏc khu vực địa lý khỏc nhau. Tớnh lặp lại của thử nghiệm phỏt hiện đột biến rpoB được đỏnh giỏ mự với bộ ADN mẫu chuẩn và đạt tương quan tốt. Tuy nhiờn, khi phõn tớch sõu hơn cỏc đột biến của chủng địa phương, chỉ cú 132/155 (85,2%) chủng khỏng RMP và 28/55 (51,0%) chủng khỏng EMB cú kết quả tương đồng. Đối với INH, 16,9% cú kết quả xỏc
định đỳng và 13,2% chủng cú đột biến ở vựng inhA và ahpC. Đột biến ở vựng rrs và rpsL liờn quan khỏng SM được xỏc định ở 15,1% và 10,7% chủng khỏng SM. Tuy vậy, phương phỏp đó được khẳng định cú tớnh chớnh xỏc thụng qua một nghiờn cứu khỏc. Nghiờn cứu thực hiện trờn 157 chủng M. tuberculosis, so sỏnh
với phương phỏp cổ điển cú độ nhạy và độđặc hiệu đạt 93% và 100%. Hơn nữa, cú sựđồng nhất cao với kết quả thử nghiệm bằng xỏc định trỡnh tự ADN.
Kỹ thuật Real-time PCR
Ngày nay, kỹ thuật Real-time PCR được ứng dụng trong xỏc định nhanh tớnh khỏng thuốc trong bệnh lao. Nhiều mẫu dũ khỏc nhau được dựng để phỏt hiện như TaqMan, mẫu dũ phỏt năng lượng huỳnh quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer probes), beacon phõn tử và mồi dũ kộp (biprobe).
Ưu điểm chớnh của phương phỏp là tốc độ và nguy cơ nhiễm thấp. Yếu điểm chớnh là đũi hỏi cỏc thiết bị và húa chất đắt,và người thực hiện cần cú kỹ năng kỹ thuật. Kỹ thuật real-time PCR được ỏp dụng cho chủng M. tuberculosis và hiện nay, trực tiếp trờn bệnh phẩm [38]. Kết quả cú được sau 1,5-2 giờ sau chiết xuất ADN. Kỹ thuật cú thể triển khai ở cỏc phũng thớ nghiệm chuẩn cú điều kiện thiết bị và cú nhõn lực được đào tạo.
Microarrays
Microarrays hoặc cũn gọi là chip sinh học hoặc chip ADN, là kỹ thuật genotype xỏc định tớnh khỏng thuốc ở chủng M. tuberculosis. Kỹ thuật dựa trờn sự lai ghộp ADN thu được từ bệnh phẩm với oligonucleotid gắn trờn giỏ rắn như
lam kớnh thu nhỏ. Kỹ thuật được thử nghiệm xỏc định tớnh khỏng INH và RMP [42]. Một dạng chip phỏt hiện ADN khỏng thuốc ở Mycobacteria vừa được đưa ra trờn thị trường là microchip oligonucleotid gắn với PCR để phỏt hiện tớnh khỏng INH và RMP (Combichip Myobacteria Drug resistance detection ADN chip). Kỹ thuật được so sỏnh với xỏc định trỡnh tự và phương phỏp cổ điển trờn 69 chủng khỏng INH và/hoặc RMP và 27 chủng nhạy cảm [58]. Kỹ thuật cho phộp xỏc định được 84,1% chủng khỏng INH, dựa trờn phỏt hiện đột biến codon 315 katG và inhA513, và 100% chủng khỏng RMP dựa trờn đột biến ở 7 codon rpoB511, rpoB513, rpoB516, rpoB522, rpoB526, rpoB531 và rpoB533. Độ đặc hiệu trung bỡnh đạt 100% và 95,3% đối với INH và RMP. Hiện tại, do giỏ thành cao, việc ỏp dụng kỹ thuật chỉ mới thực hiện được ở một số phũng thớ nghiệm lớn, đối với cỏc phũng thớ nghiệm lõm sàng, đặc biệt ở những nước đang cú tỉ lệ