* Cõy thớ nghiệm: - Giống cà chua HT152 - Giống cà chua HT 18 - Giống cà chua VL2000 - Giống cà chua Savior -Giống cà chua DV2962
* Cõy thớ nghiệm lõy bệnh nhõn tạo:
- Thuốc lỏ: Nicotiana benthamiana, N. tabacum cv. Samsun - Ớt cay: Capsicum annum L.
- Cà tớm: Solanum esculenta var. Esculentum.
- Cà phỏo: Solananum album. - Đậu đen: Vigna unguiculata.
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 18 * Mẫu bệnh xoăn vàng lỏ cà chua thu thập ở Hà Nội và một số tỉnh khỏc như: Hưng Yờn, Phỳ thọ, Hải Dương, Bắc Ninh, Thỏi Bỡnh.
* Nhà lưới trồng cõy cỏch li, phũng lõy bệnh bằng cụn trựng, hộp lồng nuụi bọ phấn.
* Cỏc húa chất, dụng cụ, mỏy múc dựng trong phương phỏp PCR.
* Thuốc Actara 25WG SL do cụng ty Syngenta cung ứng, thuốc SuperMil 20SL do cụng ty cổ phần VT BVTV Hà Nội cung ứng
* Bẫy dớnh mầu vàng chuyờn dụng do Đài Loan sản xuất.
3.3. Nội dung nghiờn cứu
1. Điều tra diễn biến, thời gian xuất hiện của bệnh virus xoăn vàng lỏ cà chua trờn ruộng cà chua vụ thu đụng 2010 tại Hà Nội và cỏc vựng phụ cận.
2. Khảo sỏt tỡnh hỡnh bệnh xoăn vàng lỏ cà chua trờn tập đoàn giống cà chua tại trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nộị
3. Lõy nhiễm nhõn tạo bằng cụn trựng mụi giới nhằm xỏc định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lỏ cà chuạ
4. Mụ tả triệu chứng và giỏm định bệnh virus gõy bệnh xoăn vàng lỏ trờn cõy cà chua bằng phương phỏp PCR.
5. Thử nghiệm một số biện phỏp phũng trừ bệnh virus hại cà chua: - Biện phỏp phũng trừ cụn trựng mụi giới truyền bệnh - bọ phấn (Bemisia tabaci Genn) bằng bẫy dớnh mầu vàng.
- Biện phỏp phũng trừ cụn trựng mụi giới truyền bệnh bằng thuốc hoỏ học: Actara 25WG, SuperMil 20SL.
3.4. Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.1. Phương phỏp điều tra diễn biến tỷ lệ bệnh và mật độ bọ phấn trờn đồng ruộng đồng ruộng
* Tiến hành điều tra theo TC10 TCN – 224 – 95 Hà Nội của Cục Bảo vệ thực vật [3]. Điều tra định kỳ 7 ngày/lần, trờn mỗi giống điều tra theo phương
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 19 phỏp 5 điểm chộo gúc, mỗi điểm điều tra 50 cõy đối với ruộng lớn (trờn 1 sào) và toàn bộ số cõy đối với ruộng nhỏ (dưới 1 sào).
* Điều tra diễn biến mật độ bọ phấn: tiến hành điều tra theo 5 điểm chộo gúc, mỗi điểm cố định 5 cõy, điều tra ngẫu nhiờn 20 lỏ/điểm dải đều ở 3 tầng lỏ.
* Chỉ tiờu theo dừi: + Tỷ lệ bệnh:
Số cõy bệnh
TLB (%) = —————————— x 100 Tổng số cõy điều tra
+ Mật độ bọ phấn:
Tổng số bọ phấn điều tra MĐBP (con/lỏ) = ———————————
Số lỏ điều tra
3.4.2. Phương phỏp thu mẫu nghiờn cứu
* Phương phỏp thu mẫu: mẫu đựng riờng trong từng tỳi nilon cú ghi cỏc thụng tin: tờn mẫu, địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, triệu chứng bệnh.
* Phương phỏp bảo quản mẫu: cú hai phương phỏp bảo quản mẫu - Phương phỏp 1: Bảo quản mẫu khụ
+ Bước 1: Sấy mẫu ở nhiệt độ 40oC cho đến khi mẫu khỏ khụ.
+ Bước 2: Mẫu được gúi trong giấy mỏng nhằm cỏch hạt Silicagen và mẫu sau đú để trong cỏc lọ thuỷ tinh nhỏ.
- Phương phỏp 2: Bảo quản tươi
Mẫu thu về được để nguyờn trong tỳi giữ lạnh ở tủ -20oC. Chỳ ý khụng đưa mẫu ra ngoài khi chưa sử dụng.
3.4.3. Xỏc định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lỏ cà chua và giỏm định virus gõy bệnh bằng phương phỏp cõy chỉ thị virus gõy bệnh bằng phương phỏp cõy chỉ thị
* Nguồn bệnh: cõy cà chua bị nhiễm bệnh xoăn vàng lỏ với triệu chứng bệnh điển hỡnh được kiểm tra ELISA cho kết quả dương tớnh.
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 20 + Giống cà chua HT152
+ Giống cà chua HT18 + Giống cà chua VL2000 + Giống cà chua Savior + Giống cà chua DV2962
+ Thuốc lỏ: Nicotiana benthamiana, N. tabacum cv. Samsun + Ớt cay: Capsicum annum L.
+ Cà tớm: Solanum esculenta var. Esculentum
+ Cà phỏo: Solananum album. + Đậu đen: Vigna unguiculata.
Cỏc cõy dựng để lõy nhiễm được gieo hạt và chăm súc trong nhà lưới để cỏch li nguồn bệnh. Tiến hành lõy nhiễm khi cõy lõy bệnh đạt 3 - 4 lỏ thật trở lờn. * Dụng cụ cần thiết: Nhà lưới cỏch li, phũng lõy bệnh bằng cụn trựng, hộp lồng nuụi bọ phấn, chậu vại dựng để trồng cõy lõy nhiễm và cõy nguồn bệnh, dụng cụ bắt bọ phấn và cỏc thiết bị khỏc.
* Vectơ truyền bệnh: Bọ phấn (Bemisia tabaci) được thu bắt trờn đồng ruộng sau đú nuụi trờn cõy sạch bệnh cho chỳng chớch hỳt và đẻ trứng, thu bắt bọ phấn trưởng thành ở thế hệ thứ hai để lõy nhiễm.
* Phương phỏp lõy nhiễm bằng bọ phần:
Bọ phấn được thả trờn cõy nguồn bệnh cho chỳng chớch hỳt một ngày sau đú chuyển sang cõy khỏe được trồng trong nhà lưới dựng để lõy nhiễm, mỗi giống 10 cõy , mỗi cõy đặt trong một hộp. Ở mỗi hộp thả 10 con bọ phấn cho chỳng truyền virus một ngày sau đú đưa ra khỏi hộp và tiến hành phun thuốc Actara 25WG nồng độ 0,01% trừ bọ phấn. Cỏc cõy đối chứng đều khụng thả bọ phấn.
* Phương phỏp Agroinoculation:
Phương phỏp : Tiờm trực tiếp vi khuẩn vào mụ (Navot et al., 1991 & Kheyr-Pour et al. Nucleic acid research vol19,No 24 , 6763-6769)
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 21 * Nguồn: Vi khuẩn Agrobacterium chứa cấu trỳc virus TYLCV (28/5/09), T01PEG (28/5/09), T02PEG (28/5/09), T0Ca1(28/5/09).
* Chuẩn bị mụi trường Mụi trường LB 1 l 250 ml Trypton 10 g 2.5 g Yest extract 5 g 1.25 g NaCl 5 g 1.25 g Agar 15 g 3.75 g Cho cỏc thành phần vàọ Lờn thể tớch. Lắc cho tan. Hấp ở 121 oC/ 15 phỳt. (mụi trường LB cú thể là lỏng (khụng cú agar) hoặc đặc (cú agar), để rút ra đĩa Petrị Nếu bổ xung khỏng sinh thỡ phải để mụi trường nguội khoảng 55 oC.
* Trỡnh tự
+ Bước 1: Lấy 1 tube Agroniculation (cú chứa cấu trỳc virus giữ trong tủ - 80o). Để trờn khay đỏ khoảng 15 – 30 phỳt cho tan đụng.
+ Bước 2: Dựng que cấy vi khuẩn, cấy vi khuẩn lờn mụi trường LB đặc đó cho 3 loại khỏng sinh: Kanamycion, Rifampicin, Steptomycin. Ủ qua đờm ở 28oC.
+ Bước 3: Cấy độ 4-5 khuẩn lạc Agroniculation vào bỡnh chứa 100ml LB lỏng chứa 3 loại khỏng sinh: Kanamycin, Rifampicin, Steptomycin Ủ tube qua đờm ở 28oC cú lắc (250 rpm / 28°C/ 2 ngày).
+ Bước 4 : Cho dung dịch LB lỏng (bước 3) vào tube 2ml bảo quản trong glyxerol 80% (tỷ lệ 1:1), đảo đều bảo quản ở tủ - 80oC = > giữ làm nguồn
+ Bước 5: Ly tõm vi khuẩn (3000 g/ 5 phỳt).
+ Bước 6 : Hũa cặn vi khuẩn với 10 ml mụi trường LB lỏng chứa 1 khỏng sinh (Kanamycion)
♦ Tiờm trực tiếp : Tiờm dịch vi khuẩn dựng kim tiờm 18 gauge vào cõy cà chua ở giai đoạn 3- 4 lỏ hoặc 8-10 lỏ. Vị trớ tiờm :
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 22
• Thõn • Cuống lỏ
• Nỏch lỏ • Chồi
♦ Tiờm giỏn tiếp : Bơm dịch vi khuẩn qua khớ khổng ở mặt dưới của lỏ - Chỉ tiờu theo dừi:
+Quan sỏt mụ tả triệu chứng.
+ Thời kỡ tiềm dục (TKTD): tớnh từ lỳc lõy nhiễm cho tới khi cõy biểu hiện triệu chứng (ngày).
3.4.4. Khảo sỏt hiệu quả của sử dụng bẫy dớnh màu vàng đối với phũng trừ bệnh xoăn vàng lỏ cà chua bệnh xoăn vàng lỏ cà chua
Thớ nghiệm nhằm đỏnh giỏ hiệu quả sử dụng bõy vàng trong việc phũng trừ bệnh xoăn vàng lỏ cà chua
* Địa điểm thớ nghiệm: Thớ nghiệm được thực hiện tại nhà lưới số 4 - Viện nghiờn cứu Rau - Hoa -Quả Gia Lõm - Hà Nội trờn giống cà chua R7.
* Thớ nghiệm gồm 2 cụng thức:
- Cụng thức 1: treo bẫy dớnh màu vàng - Cụng thức 2: khụng treo bẫy
* Chỉ tiờu theo dừi:
- Điều tra tỷ lệ bệnh xoăn vàng lỏ cà chua và mật độ bọ phấn trờn cõy 7 ngày/ lần.
- Mật độ bọ phấn vào bẫy dớnh màu vàng 5 ngày/ lần
3.4.5. Khảo sỏt hiệu quả của sử dụng thuốc húa học đối với phũng trừ bệnh xoăn vàng lỏ cà chuạ xoăn vàng lỏ cà chuạ
Thớ nghiệm được bố trớ nhằm đỏnh giỏ khả năng phũng trừ bọ phấn của bẫy dớnh màu vàng, thuốc kớch khỏng Super mil 20SL và thuốc húa học Actara 25WG
* Địa điểm thớ nghiệm: Khu trồng rau Quảng An – Tõy Hồ – Hà Nội * Giống cà chua: P375
* Thớ nghiệm được bố trớ theo kiểu khối ngẫu nhiờn đầy đủ (RCB), gồm 5 cụng thức, 1 giống, 3 lần nhắclạị
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 23 - Cụng thức 1: đối chứng.
- Cụng thức 2: treo bẫy dớnh màu vàng.
- Cụng thức 3: phun thuốc Actara 25WG 0,01%.
- Cụng thức 4: phun chất kớch khỏng SuperMil 20SL + treo bẫy vàng - Cụng thức 5: phun chất kớch khỏng SuperMil 20SL
* Chỉ tiờu theo dừi:
- Mật độ bọ phấn vào bẫy (con/bẫy) định kỳ 5 ngày/lần - Mật độ bọ phấn trờn cõy cà chua định kỡ 7 ngày/lần. - Điều tra tỷ lệ bệnh bệnh xoăn vàng lỏ cà chua 7 ngày/lần.
3.4.6. Phương phỏp bố trớ thớ nghiệm đồng ruộng
Thớ nghiệm được bố trớ nhằm nghiờn cứu hiệu quả phũng trừ của bẫy vàng đối với bệnh xoăn vàng lỏ cà chua
* Địa điểm thớ nghiệm: Quảng An – Tõy Hồ - Hà Nội * Giống cà chua: P375
* Thớ nghiệm gồm 2 cụng thức:
- Cụng thức 1: treo bẫy dớnh màu vàng - Cụng thức 2: khụng treo bẫy
* Chỉ tiờu theo dừi:
- Điều tra tỷ lệ bệnh 7 ngày/lần
- Điều tra mật độ bọ phấn vào bẫy vàng 5 ngày/lần - Điều tra mật độ bọ phấn trờn cõy 7 ngày/ lần
- Thành phần cụn trựng vào bẫy dớnh màu vàng 7 ngày/lần
3.4.7. Giỏm định virus gõy bệnh bằng phương phỏp PCR
Qua quỏ trỡnh điều tra thu thập mẫu bệnh trờn đồng ruộng, chỳng tụi đó sử dụng phương phỏp PCR (Polymenraza Chain Reaction) để chẩn đoỏn virus.
Phương phỏp PCR giỏm định virus gõy bệnh xoăn vàng lỏ gồm cỏc bước sau:
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 24
3.4.7.1. Chiết DNA tổng số từ mẫu mụ thực vật
Cú hai phương phỏp chiết DNA:
* Phương phỏp 1: DNA tổng số từ mụ lỏ được chiết nhanh bằng kiềm (NaOH) theo phương phỏp của Wang et al. (1993) như sau:
- Bước 1: Cho khoảng 50 mg mụ lỏ vào tube 1,5 ml tiếp tục cho 0,5 ml dung dịch NaOH 0,5M vào tubẹ Dựng chày nhựa nghiền nhuyễn mẫu lỏ.
- Bước 2: Hũa loóng dịch nghiền 50 lần với đệm Tris 0,1M, pH 8 (5 àl dịch nghiền hũa loóng với 245 àl đệm Tris).
- Bước 3: Lưu trữ mẫu trong tủ lạnh -20oC.
* Phương phỏp 2: Chiết tỏch DNA tổng số bằng CTAB + Bước 1:
- Cho 0,1 g mụ lỏ tươi hoặc 0,02 g mụ lỏ khụ vào tube 1,5 ml
- Cho 0,5 ml đệm CTAB + βME đó ủ ở 60oC trong 10 phỳt vào tubẹ Dựng chày nhựa nghiền nhuyễn.
- Ủ 10 phỳt ở 65oC sau đú để nguội ở nhiệt độ phũng + Bước 2:
- Cho 0,5 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1) vào tube lắc đềụ - Sau đú ly tõm 12.000/phỳt trong 10 phỳt, hỳt dịch trờn của tủa sang một tube mới (0,35ml).
+ Bước 3:
- Cho tiếp thể tớch tương đương 0,35 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1) vào tube lắc đềụ
- Ly tõm 10 phỳt, hỳt dịch trờn của tủa sang một tube mới (0,25ml). + Bước 4:
- Cho một thể tớch tương đương Propanol vào tube ,lắc đều, để lạnh - 20oC trong 10 phỳt.
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 25 + Bước 5, 6:
Rửa cặn hai lần Etol 70o (0,7 ml/lần), đảo nhẹ, đổ hết Etol. Sau đú, spin và dựng pipet hỳt hết etol thừạ
+ Bước 7:
Để khụ cạn trong khụng khớ ớt nhất 30 phỳt. + Bước 8:
Hoà cặn trong 0,1 ml nước cất 2 lần và giữ ở -20oC
3.4.7.2. Tiến hành phản ứng PCR + Thành phần của mỗi phản ứng + Thành phần của mỗi phản ứng Thành phần Thể tớch cần lấy (àL) Dd H2O 16.4 10 x PCR Buffer 2.0 dNTPs (10 mM mỗi loại) 0.3 Primer R 0.3 Primer F 0.3
DNA polymerase (Taq) (5U/ àL) 0.2
DNA tổng số 0.5
Tổng thể tớch 20
+ Quy trỡnh thực hiện phản ứng PCR
Nhiệt độ oC Thời gian Số chu kỳ
Biến tớnh khởi đầu 92 4 phỳt 1
92 35 giõy 50 35 giõy Cỏc chu kỳ tổng hợp 72 1 phỳt 30 Kết thỳc 72 5 phỳt 1 Mỏy PCR MJ100 Loại tube 0.5 mL khử trựng
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 26 + Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
- Cặp mồi chung DNA-A của begomovirus là BegoAReV1 & BegoAFor1 (Ha et al., 2006)
BegoAReV1: 5’- ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*- 3’ BegoAFor1: 5’- TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* - 3’
* Y (C/T), R (G/A), H (A/C/T), M (A/C), B (C/G/T), D(A/G/T), K (G/T) và i = inosine
- Cặp mồi đặc hiệu ToLCVV (sản phẩm = 454 bp)
Mồi xuụi dũng là ToLCVV-sp-F2 cú trỡnh tự: (vị trớ 1245) 5’ GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 3’ (vị trớ 1276)
Mồi ngược dũng là ToLCVV-sp-R2 cú trỡnh tự: (vị trớ 1683) 5’ ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC 3’ (vị trớ 1708)
- Cặp mồi đặc hiệu TYLCVNV (sản phẩm = 1386 bp)
Mồi xuụi dũng là TYLCVNV-sp-F1 cú trỡnh tự : (vị trớ 1094) 5’ TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC 3’ (vị trớ 1117)
Mồi ngược dũng là TYLCVNV-sp-R1 cú trỡnh tự: (vị trớ 2456) 5’ AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC 3’ (vị trớ 2480)
3.4.7.3. Điện di sản phẩm PCR:
* Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0,5 àl Red safe
* Gel được chạy trờn thiết bị điện di là Mini – Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở điện thế 100V trong 30 – 40 phỳt.
* Bản gel được kiểm tra dưới ỏnh sỏng tử ngoại và được chụp lại bằng mỏy chụp chuyờn dụng hoặc mỏy ảnh kỹ thuật số.
Trường Đại học Nụng Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nụng nghiệp……….. 27
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả điều tra trờn đồng ruộng
4.1.1. Mụ tả triệu chứng ngoài đồng ruộng
Bệnh xoăn vàng lỏ cà chua hay cũn gọi là bệnh xoăn vàng ngọn cà chua được coi là tỏc nhõn gõy hại nghiờm trọng trờn cà chua ở tất cả cỏc vụ trong năm: xuõn hố, đụng sớm, đụng chớnh vụ, đụng xuõn, hố thu đặc biệt vụ xuõn hố và vụ đụng sớm bệnh cú chiều hướng hại nặng hơn, tỷ lệ bệnh cao hơn [27].
Chẩn đoỏn và phỏt hiện triệu chứng bệnh là cơ sở cần thiết trong nghiờn cứu cũng như trong cụng tỏc bảo vệ thực vật. Chẩn đoỏn bệnh cõy núi chung và chẩn đoỏn bệnh virus xoăn vàng lỏ cà chua (TYLCV) núi riờng cú nhiều phương phỏp khỏc nhau, trong đú phương phỏp đơn giản nhất cú thể tiến hành ngay trờn đồng ruộng là phương phỏp quan sỏt triệu chứng bệnh.
Cõy cà chua bị nhiều loài cụn trựng, bệnh hại tấn cụng trờn đồng ruộng. Những triệu chứng gõy hại do cụn trựng tạo ra như vết gặm, cắn, đục lỏ, đục thõn thường dễ nhận biết. Những triệu chứng do bệnh hại khú nhận biết hơn đặc biệt với cỏc tỏc nhõn gõy bệnh cú triệu chứng khụng điển hỡnh, dễ nhầm với bệnh khụng truyền nhiễm (bệnh do mụi trường khụng thuận lợi gõy ra). Bệnh cú triệu chứng điển hỡnh: xoăn lỏ lỏ, làm cho lỏ co quắp, cõy thấp nhỏ, hoa phỏt triển kộm, dễ bị rụng. Nhiễm bệnh lỳc cõy cũn nhỏ cõy sẽ bị xoăn lỏ nhanh và khụng thể phỏt triển, khụng cú hoa cõy dẫn đến tàn lụị (Nguyễn Thơ, 1984)[23].
Căn cứ vào triệu chứng biểu hiện của bệnh xoăn vàng lỏ được mụ tả trong cỏc tài liệu về loại virus này, chỳng tụi tiến hành quan sỏt, chẩn đoỏn và thu thập một số mẫu bệnh tại Hà Nội (huyện Đụng Anh, huyện Gia Lõm, huyện Long Biờn) và một số tỉnh khỏc (Hải Dương, Phỳ Thọ, Bắc Ninh,