Theo Yeh và đtg (2005) thì gen eip18 là gen đặc trƣng của vi khuẩn E.
M 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-1010-11 10-12 10-13 bp 1000 500 200 bp 1000 500 250
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ictaluri nên bộ mồi cho phản ứng LAMP đƣợc thiết kế dựa trên trình tự của gen này [54]. Để kiểm tra mức độ đặc hiệu của bộ mồi đã đƣợc thiết kế, chúng tôi sử dụng DNA genome của E. ictaluri ATTC 33202 và một số DNA genome tách chiết từ các chủng vi khuẩn khác nhƣ Vibrio sp., Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, S. typhimurium, S. enteretidis, Staphylococcus aureus, E. coli, Proteus mirabilis,
Aeromonas hydrophila, Enterococcus sp. đƣợc dùng làm đối chứng âm. Sự khuếch đại đặc hiệu gen eip18 ở điều kiện tối ƣu đƣợc xác định bằng điện di trên gel 2% agarose 2%.
Hình 3.14. Độ đặc hiệu của phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18 của vi khuẩn
E. ictaluri ATCC 33202.
1,9: E. ictaluri ATCC 33202; 2: A. hydrophila; 3: E. tarda ATCC 15469; 4: Vibrio
sp.; 5: P. aeruginosa; 6: S. typhimurium; 7: S. enteritidis; 8: S. aureus; 10: E. coli;
11: P. mirabilis; 12: Enterococcus sp.; 13: đối chứng âm không bổ sung DNA; M: Marker 100 bp.
Kết quả trên hình chỉ ra rằng chỉ có các thí nghiệm mà DNA khuôn là DNA genome của các chủng E. ictaluri mới xuất hiện sản phẩm phản ứng là các băng DNA giống nhƣ thang DNA trên điện di đồ (đƣờng chạy 1 và 9, hình 3.14). Ở các đƣờng chạy khác tƣơng ứng với DNA genome tách chiết từ các chủng vi khuẩn không phải là E. ictaluri không thấy xuất hiện sản phẩm phản ứng LAMP. Điều này chứng tỏ rằng bộ mồi mà chúng tôi thiết kế cho phản ứng LAMP rất đặc hiệu để phát hiện gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.4 Phát hiện phản ứng bằng chỉ thị màu
Nồng độ DNA sau khi đƣợc khuếch đại cao hơn nhiều lần so với các phƣơng pháp khuếch đại thông thƣờng khác nhƣ PCR hoặc RT-PCR, do đó một trong những khuyến cáo đối với việc áp dụng phƣơng pháp LAMP là tuyệt đối tuân thủ các chỉ dẫn để trách sự lây nhiễm DNA trong phòng thí nghiệm. Vì vậy, việc phát hiện phản ứng bằng mắt thƣờng tỏ ra phù hợp hơn cả. Có rất nhiều phƣơng pháp khác nhau để xác định đƣợc phản ứng LAMP nhƣ dựa vào sự kết tủa của Mg2P2O7
là sản phẩm phụ của quá trình khuếch đại DNA để xác định độ đục của hỗn hợp phản ứng, hoặc dựa vào sự thay đổi màu của chất chỉ thị nhƣ SYBR Green I, Calcein hoặc HNB. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn chất chỉ thị màu là SYBR Green I do tính ổn định cao và có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thƣờng mà không cần đèn UV.
Hình 3.15. Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP với chỉ thị màu huỳnh quang SYBR Green I
Với kết quả thu đƣợc nhƣ trên, chúng tôi bƣớc đầu kết luận rằng có thể sử dụng phƣơng pháp LAMP để phát hiện nhanh vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202. Phản ứng LAMP đƣợc tiến hành trong điều kiện phản ứng tối ƣu: 4 mM Mg2+, 0,5 mM dNTP, 0,2-0,5 mM Betaine, tỉ lệ (mồi ngoài: mồi trong) là (1:6) ở 65oC trong 60 phút. Kết quả này cho thấy cặp mồi thiết kế để nhận biết gen eip18 của E. ictaluri ATCC là đặc hiệu, đủ điều kiện để sử dụng cho các nghiên cứu khác sau này về E. ictaluri.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN
Với những kết quả đạt đƣợc nhƣ đã trình bày ở trên, chúng tôi đi đến những kết luận sau:
1. Thiết kế thành công và đặc hiệu các cặp mồi để phát hiện gen eip18
của vi khuẩn Edwarsiella ictaluri ATCC 33202.
2. Ứng dụng thành công phƣơng pháp LAMP trong việc phát hiện đoạn
gen eip18 của vi khuẩn Edwarsiella ictaluri ATCC 33202. 3. Tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện của phản ứng LAMP.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa (2005), Bệnh
học thủy sản, Đại học Cần Thơ.
2. Từ Thanh Dung, Nguyễn Ngọc, Nguyễn Quang Thịnh, Đoàn Thị Mai Thy,
M Crumlish, H W Ferguson (2003), Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng
trên gan cá Tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long, Đại học Cần Thơ và Viện Thủy Sản, Đại học Stirling
3. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004),
Giáo trình bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
4. Lý Thị Thanh Loan (2007), Bước đầu phát hiện Clostridium sp cảm nhiễm trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi ở ĐBSCL Việt Nam. Trung tâm quốc gia quan trắc, cảnh báo môi trƣờng và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực Nam bộ - Viện nghiên cứu NTTS II.
5. Trƣơng Thanh Loan, Nguyễn Hữu Thịnh và Lƣu Thị Thanh Trúc (2007),
Khảo sát hiện trạng nuôi cá tra thâm canh ở tỉnh Đồng Tháp và mô tả một số đặc điểm của vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ. Nghiên cứu khoa học kỹ thuật, bộ môn Thủy sản và bộ môn Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh.
6. Bùi Đức Mạnh (2008), Nghiên cứu phát hiện nhanh một vào loại vi khuẩn gây bệnh ở cá nước ngọt bằng kĩ thuật sinh học phân tử. Luận văn thạc sĩ Khoa học Sinh học, Đại học Cần thơ, Cần thơ.
Tiếng Anh
7. Anonymous K (1989), U.S. catfishlosses 1988, Water Farming J. 4(3):16. 8. Anonymous K (1990); Disease top cause of losses in 1989, Catfish J. 4(7):8.
9. Arias CR, Shoemaker CA, Evans JJ, Klesius PH (2003) A comparative study
Edwarsiella ictaluri parent (EILO) and E. ictaluri rifampicin-mutant (RE-33) isolates using lipopysaccharide, outer membrane proteins, fatty acids, Biolog, AIP 20E and genomic analysis. J. Fish. Dis. 26: 415-421.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10. Bertolini JM, Cipriano RC, Pyle SW, Mclaughlin JA (1990), Serological investigation of the fish pathogen Edwardsiella ictaluri, cause of enteric septicemia of catfish, J. Wild Dis., 26:246-250.
11. Bilodeau AL, Waldbieser GC, Terhune JS, Wise DJ, Wolters WR (2003), A
real-time polymerase chain reaction assay of the bacterium Edwardsiella ictaluri, J. Aquat. Anim. Health, 15: 80–86.
12. Buchanan RE, Gibbons NE (1974), Bergey’s manual of determinative bacteriology, The Williams & Wilkins Co., Baltimore.
13. David JW, Philip HK, Craig AS and William RW (2000), “Vaccination of mixed and full-sib families of channel catfish Ictalurus punctatus against enteric septicemia of catfish with a live attenuated Edwardsiella ictaluri
isolate (RE-33)”, J. Aquac. society, 31(2): 167-172.
14. Edwards PR, Ewing WH (1972), Identification of Enterobacteriaceae, Burgess Publishing Co., Minneapolis.
15. Endo S, Komori T, Ricci G, Sano A, Yokoyama K, Ohori A, Kamei K, Franco M, Miyaji M, Nishimura K (2004) Detection of ga43 of
paracoccidiodes brasiliensis by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method. FEMSMicrobiol. Lett. 234:93-97.
16. Ewing WH, McWhorter AC, Escobar MR, Lubin AH (1965), Edwardsiella,
a new genus of Enterobacteriaceae based on a new species, E. tarda, Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon, 15:33-38.
17. Fernandez DH, Pittman-Cooley L, Thune RL (2001), Sequencing and analysis of the Edwardsiella ictaluri plasmids, Plasmid, 45:52-6
18. Hawke JP, McWhorter AC, Steigerwalt AG, Brenner DJ (1981),
Edwardsiella ictaluri sp. nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish, International J. Systemc Bacteriol, 31:396-400.
19. Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K (2003) Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex,
M. avium and M. intracellulare in sputum samples. J. Clin. Microbiol. 41: 2616 – 2622.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20. Lobb C. J., Ghaffari S. H., Hayman J. R., Thompson D. T. (1993), Plasmid and serological differences between Edwardsiella ictaluri strains, Appl. Environ Microbiol, 59:2830-6.
21. Michael JJ, Sharon L, Susan KB, Wendy KW, Catherine P, Robert PK, Tamura (1991), Pathogenic properties of Edwardsiella Species, J.Clini. Microbiol. 29(9): 1997-2001.
22. Michelle MM, Denise LF, Ronald LT (2002), Cloning and characterization of Edwardsiella ictaluri proteins expressed and recognized by the channel catfish Ictalurus punctatus immune response during infection, Dis. Aquat. Ogan, 52(2): 93-107.
23. Motoki Goto, Eiichi Honda, Atsuo Ogura, Akio Nomoto (2009),
Colorimetric detection of loop mediated isothermal amplification reaction by using hydroxyl naphtha blue, Bio technique, 46: 167-172.
24. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N,
Hase T (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids Res. 15: E63.
25. Panangala VS, Shoemaker CA, Van Santan VL, Kleisius PH (2005), Analysis of 16S-23S intergenic spacer regions of the rRNA operons in
Edwardsiella ictaluri and Edwardsiella tarda isolates from fish, J. Appl. Microbiol., 99(3): 657-669.
26. Panangala VS, Shoemaker CA, Van Santan VL, Dybvig K, Kleisius P.H. (2007), Multiplex-PCR for stimultanous detection of three fish-pathogenic bacteria Edwardsiella ictaluri, Flavobacterium columnare and Aeromonas hydrophila, Dis. Aquat. Organisms, 74: 199-208.
27. Poon LLM, Leung CSW, Tashiro M, Chan KH, Wong BWY, Yuen KY, Guan Y, Peiris JSM (2004) Rapid detection of the severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a loop-mediated isothermal amplification assay. Clin. Chem. 50: 1050-1052.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28. Plumb JA, Vinitnantharat S (1989), Biochemical, biophysical, and serological homogenity of Edwardsiella ictaluri, J. Aquat. Anim. Health, 1: 51–56.
29. Savan R, Igarashi A, Matsuoka S, Sakai M (2004) Sensitive and rapid detetcion of Edwardsiellosis in fish by a loop-mediated isothermal amplification method. Appl. Environ. Microbiol. 70(1): 621-624.
30. Shotts EB, Waltman WD (1990), A medium for the selective isolation of
Edwardsiella ictaluri, J. Wildl. Dis., 26: 214–218.
31. Thune RL, Collins LA, Pena MP (1997), A comparison of immersion, immersion/oral combination and injection methods for the vaccination of channel catfish Ictalurus punctatus against Edwardsiella ictaluri. J. World Aquacult Soc., 28:193–201.
32. Waltman WD, Shotts EB, Hsu TC (1986), Biochemiacal characteristics of
Edwardsiella ictaluri, Applied and environmental microbiology, 51(1): 101- 104.
33. William ML, Lawrence ML (2005), Identification and chracterizaion of two component hemolysin from Edwardsiella ictaluri, Vet. Microbiol., 108: 281- 289.
34. Yeh HY, Shoemarker CA, Klesius PH (2005), Evaluation of a loop- mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punstatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. J. Microbiol. Method 63: 36-44.
35. Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, Usui C, Miyake F, Suga S, Enomoto Y,
Suzuki R, Nishiyama Y, Asano Y (2004) Detection of human herpesvirus 7 DNA by loop-mediated isothermal amplification. J. Clin. Microbiol.
42:1348-1352.
Tài liệu trên internet:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
37.http://www.ctu.edu.vn/departments/dra/2010/so13/19 38.http://www.khachsanexpress.com
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU.. ... 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 2
1.1 VI KHUẨN Edwardsiella ... 2
1.2 BỆNH GAN THẬN MỦ ... 5
1.2.1 Tác nhân gây bệnh gan thận mủ ... 5
1.2.2 Tình hình bệnh dịch ... 6
1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E. ictaluri ... 9
1.3.1 Phƣơng pháp truyền thống ... 10
1.3.2 Phƣơng pháp hiện đại ... 11
1.4 PHƢƠNG PHÁP LAMP ... 12
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 16
2.1 VẬT LIỆU ... 16
2.1.1 Chủng vi sinh vật ... 16
2.1.2 Hoá chất, enzyme, máy móc ... 16
2.1.3 Các loại môi trƣờng ... 16
2.1.4 Các dung dịch sử dụng ... 17
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 18
2.2.1 Tách chiết DNA genome của vi khuẩn ... 18
2.2.2 Tách plasmid từ vi khuẩn ... 19
2.2.3 Kỹ thuật PCR ... 20
2.2.4 Phản ứng nối ghép gen ... 21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.6 Chọn lọc các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp ... 23
2.2.7 Cắt DNA plasmid bằng enzyme hạn chế ... 23
2.2.8 Tinh sạch sản phẩm DNA plasmid bằng QIAGEN kit ... 24
2.2.9 Phƣơng pháp LAMP ... 24
2.2.10 Điện di DNA ... 25
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 27
3.1 Phân lập và xác định trình tự gen eip18 vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202 ... 27
3.1.1 Phân lập gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202 ... 27
3.1.2 Xác định trình tự gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202 ... 28
3.1.2.1 Tách dòng gen eip18 bằng vector pJET 1.2/blunt ... 28
3.1.2.2 Xác định trình tự gen eip18 ... 31
3.2 Phƣơng pháp LAMP ... 32
3.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP ... 32
3.2.2 Phản ứng LAMP ... 32
3.2.3 Tối ƣu các điều kiện phản ứng LAMP ... 33
3.2.3.1 Ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ ... 33
3.2.3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ dNTP ... 34
3.2.3.3 Ảnh hƣởng của tỉ lệ mồi ... 35
3.2.3.4 Ảnh hƣởng của nồng độ Betaine ... 35
3.2.3.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng ... 36
3.2.3.6 Ảnh hƣởng của thời gian phản ứng... 37
3.2.3.7 Độ nhạy của phản ứng LAMP ... 38
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.4 Phát hiện phản ứng bằng chỉ thị màu ... 40