3.1.2.1 Tách dòng gen eip18 bằng vector pJET 1.2/blunt
Vector pJet 1.2 là vector tách dòng đầu bằng, có khả năng mang các đoạn gen ngoại lai có kích thƣớc từ 6 bp đến 10 kb. Để tiến hành tách dòng gen eip18, sản phẩm PCR trƣớc khi gắn vào vector đƣợc làm bằng đầu bằng DNA blunting enzyme ở nhiệt độ 70oC trong 10 phút. Khi có gen ngoại lai đƣợc chèn vào vùng đa điểm cắt của vector thì tế bào có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chứa kháng sinh, nếu không chèn đƣợc thì tế bào sẽ chết. Thực hiện phản ứng với sản phẩm PCR đƣợc gắn vào vector pJet 1.2 và biến nạp và tế bào E. coli DH 10B. Song song tiến hành với đối chứng là một đoạn DNA có kích thƣớc 976 bp (đã cho sẵn trong kit) cũng đƣợc gắn vào vector và biến nạp vào tế bào E. coli DH 10B. Các khuẩn lạc chứa plasmid mang gen eip18 đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng LB chứa ampicillin. Chọn lọc ngẫu nhiên một số khuẩn lạc mọc từ các đĩa cấy trải để tách
M E.i
500bp 480bp
1 kp
M E.i ĐC (-)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chiết DNA plasmid. Plasmid tách đƣợc ngoài phần gốc của vector tách dòng pJet 1.2 còn gắn thêm gen ngoại lai có kích thƣớc 480 bp nên có kích thƣớc bé hơn so với đối chứng dƣơng là vector pJet 1.2 gắn thêm đoạn đối chứng PCR kích thƣớc 976 bp do đó sẽ di chuyển nhanh hơn so với plasmid đối chứng khi đƣợc điện di trên gel agarose. Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid các dòng Ei/1, Ei/8, Ei/10 nhƣ hình 3.2
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid tách từ thể biến nạp Qua ảnh điện di ta thấy DNA plasmid các dòng Ei/1, Ei/10, đều chạy nhanh hơn so với đối chứng. Điều đó chứng tỏ các dòng DNA plasmid này có khả năng là các DNA plasmid mang gen mong muốn.
Kiểm tra sự mang gen eip18 của vector tái tổ hợp bằng phản ứng cắt với enzyme cắt hạn chế:
Dòng Ei/10 đƣợc chọn để kiểm tra sự có mặt của DNA plasmid bằng các enzyme cắt hạn chế. Trên vector tách dòng pJet 1.2 có hai điểm nhận biết của enzyme Bgl II tại 2 đầu đoạn gen đƣợc chèn vào và trên đoạn gen eip18 có 1 điểm nhận biết của enzyme Kpn I trong khi đó vector pJet 1.2 không có. Do đó, khi cắt plasmid bằng enzyme Bgl II sẽ cho ta 2 băng: một băng có kích thƣớc tƣơng ứng của vector pJet 1.2 gốc (2974 bp), một băng có kích thƣớc tƣơng ứng với sản phẩm PCR mà ta chèn vào (519 bp) còn đối chứng cho băng có kích thƣớc 1033 bp. Còn nếu cắt mở vòng bằng enzyme Kpn I thì chỉ cho ta một băng với kích thƣớc bằng tổng kích thƣớc của vector và đoạn gen đƣợc chèn vào. Kết quả đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% nhƣ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.3. (A) Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng Bgl II (M: marker 1kp); (B) Kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng Kpn I (M: marker 1kp).
Kết quả cho thấy dòng tế bào Ei/10 khi cắt bằng enzyme Bgl II cho 2 băng với kích thƣớc đúng nhƣ dự kiến, 1 băng đúng tƣơng ứng kích thƣớc đoạn gen đƣợc chèn vào 519 bp, trong khi đó đối chứng xuất hiện một băng 1033 bp. Khi cắt mở vòng bằng enzyme Kpn I thì dòng Ei/10 xuất hiện 1 băng DNA. Điều đó chứng tỏ vector tách dòng pJet 1.2 có mang gen eip18.
Xác định lại sự có mặt của gen eip18 trên vector tách dòng pJet 1.2 bằng phản ứng PCR
Các dòng biến nạp ở trên đƣợc tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu dành cho gen eip18 với chu trình nhiệt nhƣ đã trình bày để kiểm tra sự có mặt của gen eip18, đối chứng âm không có DNA, đối chứng dƣơng là E. ictaluri ATCC 33202. Kết quả cho thấy dòng biến nạp Ei/10 chứa vector mang gen đích với kích thƣớc 480 bp. Hình ảnh điện di trên gel agarose 1,2% nhƣ sau:
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ dòng biến nạp (M: marker 1 kp)
2974 bp 519 bp A B 3000bp 1000bp 250bp M Ei/10 ĐC(-) Ei 480bp 500bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Để xác định trình tự đoạn gen eip18 đặc trƣng cho vi khuẩn E. ictaluri, DNA plasmid từ dòng tế bào biến nạp đƣợc tiến hành tinh sạch bằng QIAGEN Kit (Invitrogen) và thực hiện giải trình tự gen.
3.1.2.2 Xác định trình tự gen eip18
Để xác định trình tự gen eip18, vector tái tổ hợp đƣợc dùng để làm khuôn chạy PCR để đọc trình tự trên ABI PRISM 3100 Avant Genric Analyzer. Trình tự đoạn gen thu đƣợc có độ dài 437 bp đƣợc sử dụng để so sánh với trình tự gen eip18
đã đƣợc công bố trên Genbank với số đăng ký NC_012779.1 bằng chƣơng trình Blast cho thấy, trình tự gen eip18 của E. ictaluri ATCC 33202 tƣơng đồng 98% so với gen eip18 đã đƣợc đăng ký trên Genbank.
Hình 3.5. So sánh trình tự gen eip18 của Ei/10 với vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202 đã đƣợc công bố trên Genbank
Nhƣ vậy, sử dụng kỹ thuật PCR với mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu đã nhân dòng và xác định đƣợc trình tự của gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202. Gen
Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i Ei/10 E.i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn eip18 thu đƣợc có độ dài 437 bp tƣơng đồng 100% với gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri đƣợc công bố trên NCBI với số đăng kí NC_012779.1
Trên cơ sở gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri ATCC, chúng tôi tiến hành thiết kế mồi đặc hiệu nhằm phát hiện gen eip18 bằng phƣơng pháp LAMP.
3.2 Phƣơng pháp LAMP
3.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP
Để thiết kế mồi cho phản ứng LAMP phát hiện đặc hiệu E. ictaluri ATCC 33202chúng tôi đã sử dụng trình tự gen eip18 của vi khuẩn này nhƣ đã đọc trình tự.
Trình tự này đƣợc phân tích để tìm ra 6 trình tự đặc hiệu, 4 trình tự trên sợi DNA khuôn và hai trình tự trên DNA bổ sung. Bộ mồi LAMP gồm 4 mồi đƣợc sơ đồ hóa theo mô tả sơ bộ ở hình 1: mồi ngoài xuôi F3, mồi ngoài ngƣợc B3, mồi trong xuôi FIP và mồi trong ngƣợc BIP. Ở đây, mỗi mồi FIP và mồi BIP nhận biết một trình tự đặc hiệu trên sợi khuôn và một trình tự trên sợi bổ sung, giữa hai trình tự này đƣợc ngăn cách bởi 4 nucleotide T (tttt). Các m ồi này đƣợc tổng hợp b ởi hãng IDT (Integrated DNA Technology), Mỹ.
Bảng 3.2: Trình tự các mồi LAMP
Tên
mồi Loại mồi
Chiều dài mồi (nucleotide)
Trình tự mồi 5’-3’
F3 Mồi ngoài xuôi 18 TAAGACTCCAGCCCTCGG
B3 Mồi ngoài ngƣợc 18 ACTTTCCCTCGCTGGAAG
FIP Mồi trong xuôi
F1c TTTT F2
44 (F1c: 22, F2: 18) CAGGAAACCATTGATTTCGCC
TTTT CCGCCTTACCGCTCTGAT
BIP Mồi trong ngƣợc
B1c TTTT B2
44 (B1c: 20, B2: 20) CCAGAGGCCCCGGAGCAGTC
TTTTGCGTAAGTTCGCCTTCTGT
3.2.2 Phản ứng LAMP
Chúng tôi tiến hành phản ứng LAMP với 2 cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự của gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri. DNA khuôn là DNA genome của E. ictaluri ATCC 33202 và một số chủng khác dùng làm đối chứng âm. Phản
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ứng đƣợc tiến hành trong điều kiện và thành phần phản ứng đã đƣợc trình bày trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Sản phẩm đƣợc điện di trên gel agarose 2% nhƣ sau:
Hình 3.6. Sản phẩm phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18 của E. ictaluri
ATCC.1: Đối chứng âm, không có DNA; 2: E. ictaluri ATCC; M: marker 1kp Dựa vào kết quả điện di ta thấy chỉ có genome của E. ictaluri đƣợc khuếch đại sau phản ứng LAMP và xuất hiện một dải băng DNA giống nhƣ thang DNA chuẩn với băng DNA thấp nhất có kích thƣớc khoảng 230 bp. Từ đó có thể kết luận rằng phản ứng LAMP với các thành phần nhƣ đã trình bày đã khuếch đại đặc hiệu đoạn DNA có kích thƣớc 230 bp của gen eip18. Kết quả trên cho thấy các mồi mà chúng tôi thiết kế là đặc hiệu cho vi khuẩn E. ictaluri. Các mồi này hoàn toàn có thể đƣợc sử dụng để phát hiện gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri.
3.2.3 Tối ƣu các điều kiện phản ứng LAMP
Từng thành phần của phản ứng LAMP lần lƣợt đƣợc tối ƣu để tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho phản ứng khuếch đại gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202.
3.2.3.1 Ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+
Phản ứng LAMP đƣợc thực hiện với nồng độ MgSO4 đi từ 0 – 7 mM. Kết quả thu đƣợc tại nồng độ 4 mM (đƣờng chạy số 10) đã khuếch đại đƣợc gen đích. Ở những nồng độ Mg2+ cao hơn thì hàm lƣợng DNA đƣợc khuếch đại cũng không
thay đổi so với nồng độ 4 mM. Vì vậy, nồng độ Mg2+
là 4 mM đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Đối với mỗi nồng độ Mg2+, thực hiện song song một phản ứng không có DNA làm đối chứng.
M 1 2
bp
250 1000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.7: Ảnh hƣởng của nồng độ MgSO4 đến phản ứng LAMP
1-2: 0 mM MgSO4; 3-4: 1 mM MgSO4; 5-6: 2 mM MgSO4; 7-8: 3 mM
MgSO4; 9-10: 4 mM MgSO4; 11-12: 5 mM MgSO4; 13-14: 6 mM MgSO4; 15-16: 7 mM MgSO4; Các đƣờng chạy lẻ là đối chứng không có DNA. M: marker 100 bp
3.2.3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ dNTP
Nồng độ Mg2+ tối ƣu vừa xác định đƣợc sử dụng tiếp tục thực hiện tối ƣu nồng độ dNTP của phản ứng LAMP. Nồng độ dNTP lần lƣợt đi từ 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 mM. Song song với mỗi nồng độ dNTP, thực hiện một phản ứng không có DNA làm đối chứng. Kết quả thu đƣợc cho thấy rằng ở các đƣờng chạy số 8, 10, 12, 14, 16 đã xuất hiện sản phẩm phản ứng LAMP phân bố giống nhƣ thang DNA nhƣng lƣợng DNA đƣợc khuếch đại trong các phản rất khác nhau. DNA đƣợc khuếch đại nhiều nhất ở đƣờng chạy số 16, tƣơng đƣơng với nồng độ dNTP là 0,7 mM. Nồng độ dNTP này thấp hơn rất nhiều so với các công bố về việc sử dụng dNTP để khuếch đại gen đặc trƣng của vi khuẩn [29]. Trong thí nghiệm này dNTP ở nồng độ 0,5 mM đã có thể khuếch đại một cách rõ ràng gen đích.
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ dNTP đến phản ứng LAMP 1-2: 0 mM; 3-4: 0,1 mM; 5-6: 0,2 mM; 7-8: 0,3 mM; 9-10: 0,4 mM; 11- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M bp 1000 500 200 bp 1000 500 200
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12: 0,5 mM; 13-14: 0,6 mM; 15-16: 0,7 mM. Các đƣờng chạy lẻ là đối chứng không có DNA. M: marker 100 bp
3.2.3.3 Ảnh hƣởng của tỉ lệ mồi
Sử dụng nồng độ Mg2+, dNTP tối ƣu đã xác định ở trên, phản ứng LAMP tiếp tục đƣợc thực hiện với các mồi có tỉ lệ (mồi ngoài:mồi trong) là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7 1:8 để khuếch đại đặc hiệu gen eip18. Nồng độ mồi ngoài có trong mỗi phản ứng là 2 pmol. Đối với mỗi nồng độ tỉ lệ mồi thực hiện song song một phản ứng không có DNA khuôn làm đối chứng. Sản phẩm phản ứng LAMP kiểm tra sự ảnh hƣởng của tỉ lệ mồi đƣợc phân tích trên gel agarose 2%. Kết quả cho thấy, DNA đã đƣợc khuếch đại ngay khi tỉ lệ mồi là 1:2. Khi nồng độ mồi trong cao hơn thì lƣợng DNA đƣợc khuếch đại nhiều hơn. Và ở tỉ lệ 1:4 thì phản ứng LAMP cho hàm lƣợng DNA đƣợc khuếch đại ổn định (ứng với đƣờng chạy 8) ngay cả khi thực hiện các thí nghiệm riêng biệt.
Hình 3.9: Ảnh hƣởng của tỷ lệ (mồi ngoài: mồi trong) đến phản ứng LAMP 1-2: tỉ lệ 1:1; 3-4: tỉ lệ 1:2; 5-6: tỉ lệ 1:3; 7-8: tỉ lệ 1:4; 9-10: tỉ lệ 1:5; 11-12: tỉ lệ 1:6; 13-14: tỉ lệ 1:7; 15-16: tỉ lệ 1:8. Các đƣờng chạy lẻ là đối chứng không có DNA. M: marker 100bp (Fermentas)
3.2.3.4 Ảnh hƣởng của nồng độ Betaine
Năm 2005, Yeh và đtg đã công bố khi tăng nồng độ betaine thì lƣợng sản phẩm phản ứng LAMP cũng tăng. Sử dụng nồng độ Mg2+, dNTP và tỉ lệ (mồi ngoài: mồi trong) tối ƣu đã xác định đƣợc, phản ứng LAMP đƣợc thực hiện với nồng độ betainecuối cùng trong từng phản ứng thay đổi: 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 M. Đối với mỗi nồng độ betaine, thực hiện song song một phản ứng không có DNA khuôn làm đối chứng. Kết quả cho thấy rằng betaine ở nồng độ 0,1 M, sản
bp
1000 500 200
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
phẩm phản ứng LAMP đã đƣợc khuếch đại rõ ràng. Khi nồng độ betaine trong các phản ứng tăng lên thì các băng DNA xuất hiện to và rõ ràng hơn. Nhƣng sản phẩm phản ứng bắt đầu giảm khi nồng độ betaine trong phản ứng cao hơn 0,6 mM. Nhƣ vậy, chúng ta có thể sử dụng nồng độ betaine trong các phản ứng LAMP để khuếch đại một phần gen eip18 là từ 0,2 đến 0,5 mM.
Hình 3.10. Ảnh hƣởng nồng độ betaine đến phản ứng LAMP
1-2: 0 mM; 3-4: 0,1 mM; 5-6: 0,2 mM; 7-8: 0,3 mM; 9-10: 0,4 mM; 11- 12: 0,5 mM; 13-14: 0,6 mM; 15-16: 0,7 mM. Các đƣờng chạy lẻ là đối chứng không có DNA. M: marker 100 bp
3.2.3.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng
Theo khuyến cáo của nhà cung cấp, hoạt tính tối ƣu của Bst DNA polymerase đạt đƣợc ở nhiệt độ 65o
C. Nhƣng một số tác giả lại công bố kết quả phản ứng tốt nhất xảy ra ở các nhiệt độ thấp hơn [15, 19, 27]. Sử dụng nồng độ Mg2+, dNTP, tỉ lệ (mồi ngoài: mồi trong) và nồng độ betaine tối ƣu đã xác định đƣợc, chúng tôi thực hiện phản ứng LAMP ở một số nhiệt độ khác nhau, bao gồm: 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 và 75oC. Kết quả cho thấy nhiệt độ thích hợp để phản ứng xảy ra nằm trong khoảng từ 55oC đến 67o
C và nhiệt độ tối ƣu là 65oC. Ở nhiệt độ 65oC sản phẩm phản ứng LAMP đã tạo thành các băng DNA giống nhƣ thang DNA, còn ở các nhiệt độ thấp hơn sản phẩm phản ứng LAMP chƣa tập trung thành các băng DNA mà tạo thành một dải DNA có kích thƣớc rất khác nhau.
bp
1000 500
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phản ứng LAMP M: marker 100 bp
3.2.3.6 Ảnh hƣởng của thời gian phản ứng
Trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh thì thời gian chẩn đoán đóng vai trò hết sức quan trọng trong điều trị. Một số phƣơng pháp phát hiện thƣờng dùng trong phòng thí nghiệm nhƣ phƣơng pháp vi sinh (cần 4 đến 7 ngày), phƣơng pháp PCR truyền thống (khoảng 180 phút). Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng thời gian cần thiết cho phản ứng LAMP cho kết quả tốt là dƣới 60 phút [19, 29]. Tùy từng bộ mồi, gen đƣợc sử dụng mà chúng ta xác định đƣợc thời gian thích hợp sử dung cho phản ứng. Sử dụng nồng độ Mg2+, dNTP, tỉ lệ (mồi ngoài: mồi trong), nồng độ betaine và nhiệt độ phản ứng tối ƣu đã xác định đƣợc, chúng tôi tiến hành dừng phản ứng LAMP ở một số thời điểm khác nhau, bao gồm: 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65 phút sau khi thực hiện phản ứng. Kết quả thu đƣợc cho thấy rằng sau 40 phút phản ứng thì sản phẩm LAMP đã đƣợc khuếch đại để có thể quan sát bằng mắt thƣờng sau khi điện di. Tuy nhiên, hàm lƣợng DNA và sự ổn định của kết quả thí nghiệm xảy ra sau 60 phút phản ứng.
Bp
1000
500
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của thời gian đến phản ứng LAMP M: marker 100 bp
3.2.3.7 Độ nhạy của phản ứng LAMP