- Trong thí nghiệm này, một số chỉ tiêu về sinh học sinh sản của cá hồi vân đƣợc xác định bao gồm: Phân biệt đực cái, tuổi thành thục, kích thƣớc thành thục, hệ số thành thục, sức sinh sản, mùa vụ sinh sản, quá trình phát triển tuyến sinh dục,… của cá hồi vân nuôi trong điều kiện tỉnh Lâm Đồng.
NGHIÊN CỨU CHO SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ HỒI VÂN
(Oncorhynchus mykis Walbaum, 1792) TẠI LÂM ĐỒNG
Thử nghiệm sinh sản nhân tạo:
- Tuyển chọn và cho đẻ cá bố mẹ - Thu trứng và tinh, thụ tinh - Ấp nở trứng
Nghiên cứu ảnh hƣởng của mật độ ƣơng
- GĐ Bột – Hƣơng: 1.000, 1.500, 2.000 con/m2 - GĐ Hƣơng – Giống: 200, 300 và 400 con/m2
Các chỉ tiêu cần xác định:
Xác định mùa vụ sinh sản, tuổi thành thục, hệ số thành thục, giai đoạn phát triển tuyến sinh học, sức sinh sản,… Xác định tỷ lệ đẻ, thụ tinh, nở,…
Tốc độ sinh trƣởng về khối lƣợng (AGR, WG) Tỷ lệ sống
Phân tích số liệu, kết luận và đề xuất ý kiến
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh sản:
- Kích thƣớc thành thục - Tuổi thành thục - Mùa vụ sinh sản
+ Cá thí nghiệm: Cá hồi vân đƣa vào thí nghiệm đạt 1 - 2 năm tuổi, khối lƣợng trung bình 500 – 1.600 g/con. Đây là nguồn cá giống nhập về từ Mỹ, ấp nở từ trứng đã thụ tinh nuôi trong thời gian 1 – 2 năm. Sau đó, tiến hành chọn những con có kích thƣớc lớn, khỏe mạnh, màu sắc tƣơi sáng,… đƣa vào nuôi vỗ và theo dõi đặc điểm sinh học sinh sản trong điều kiện nuôi tại Lâm Đồng.
Hình 2.2. Ao nuôi vỗ cá hồi bố mẹ
+ Hệ thống nuôi: Cá đƣợc nuôi trong các ao lót bạt hình tròn, đƣờng kính 12 m, độ sâu 1,5 m tƣơng ứng với thể tích là 140 m3. Nƣớc đƣợc cung cấp trực tiếp, liên tục từ nguồn nƣớc suối với lƣu tốc ổn định trong khoảng 0,2 – 0,3 m3/phút.
+ Mật độ nuôi 2 con/m3, thức ăn nhập khẩu Skreeting (Pháp) có hàm lƣợng protein (39 – 41%), lipid (22 – 24%) và kích cỡ (6 – 8 mm) tùy theo giai đoạn sinh trƣởng của cá. Tỷ lệ cho ăn dao động từ 1,3 – 1,7% khối lƣợng thân tùy thuộc vào nhiệt độ nƣớc (thƣờng là 16oC, tăng khi nhiệt độ tăng), kích cỡ (giảm khi cỡ cá tăng) và khả năng ăn mồi của cá.
+ Chăm sóc và quản lý: Định kỳ kiểm tra các yếu tố môi trƣờng nƣớc: nhiệt độ nƣớc (2 lần/ngày), hàm lƣợng ôxy hòa tan, pH, hàm lƣợng NH3 và H2S (1 tuần/lần) hoặc khi có sự cố bất thƣờng về thời tiết và môi trƣờng nƣớc. Đồng thời, thƣờng xuyên theo dõi hoạt động ăn mồi, tình trạng sức khỏe của cá nhằm phát hiện và xử lý các sự cố một cách kịp thời. Duy trì các yếu tố môi trƣờng trong phạm vi thích hợp cho sự sinh trƣởng và thành thục sinh dục của cá. Các yếu tố môi trƣờng nƣớc đƣợc đo bằng các thiết bị và dụng cụ thông thƣờng: nhiệt độ (nhiệt kế, độ chính xác 1oC), hàm lƣợng oxy đƣợc đo bằng máy đo oxy chuyên dụng (độ chính xác 0,1 mg oxy/L), pH đo bằng test pH (độ chính xác 0,1 đơn vị), NH3 và H2S (test NH3 và H2S độ chính xác 0,01 mg/L).
Phương pháp xác định một số chỉ tiêu sinh học sinh sản: Phân biệt đực cái:
Tiến hành quan sát và mô tả các đặc điểm hình thái bên ngoài khi cá đã thành thục sinh dục. Các căn cứ để phân biệt đực cái có thể dựa vào đặc điểm của đầu cá, cơ quan sinh dục ngoài, màu sắc của cá,…
Sự phát triển tuyến sinh dục:
Hàng tháng, tiến hành thu và giải phẫu 5 cá đực và 5 cá cái 2 – 3 tuổi để phân tích và xác định các chỉ tiêu sinh học sinh sản. Cá đƣợc xác định khối lƣợng (độ chính xác 10 g) trƣớc khi giải phẫu kiểm tra. Sau đó, tiến hành giải phẫu, thu và cân tuyến sinh dục nhằm xác định hệ số thành thục sinh dục. Mẫu tuyến sinh dục đƣợc cắt ở 3 phần (đầu, giữa và cuối) rồi cố định trong dung dịch Bouin để phân tích tổ chức học.
Phương pháp làm tiêu bản tổ chức học tuyến sinh dục
Phƣơng pháp làm tiêu bản tổ chức tuyến sinh dục (buồng trứng và buồng sẹ) đƣợc thực hiện theo quy trình của Lightner [68] bao gồm các bƣớc sau:
(1) Chuẩn bị mẫu: Lấy mẫu ra khỏi cồn, cắt nhỏ mẫu sao cho khối mô chỉ dày 28 mm. Đánh dấu các mẫu để tránh nhầm lẫn, cho mẫu vào các bình cố định.
Rút nƣớc mẫu nghiên cứu: sau khi lấy mẫu ra khỏi dung dịch cồn 70o, ngâm trong cồn 95% trong 4 giờ, ngâm trong cồn 100% trong 4 giờ, ngâm trong Methyl Salicylate 12 - 24 giờ. Thấm trong parafin nóng chảy ở 65oC trong ít nhất 6 tiếng.
(2) Đúc mẫu trong Parafin: Sử dụng máy đổ parafin đã nóng chảy vào khuôn đã chứa mẫu, để trên dàn lạnh khoảng 30 phút cho mẫu parafin đông cứng lại. Lấy dao gọt khối parafin chứa mẫu thành hình thang hoặc hình chữ nhật.
(3) Cắt lát mẫu: Gắn khối parafin lên đế gỗ và dán nhãn. Gắn đế gỗ có mẫu vào máy microtom, cắt lát có độ dày 5 - 7 micron. Đƣa lát cắt vào nƣớc ấm (40 - 45oC) khoảng 1 - 2 phút để lát cắt giãn, không bị nhăn. Dùng lam sạch lấy lát cắt ra khỏi nƣớc và sấy trên máy sấy ở nhiệt độ 45 - 60oC trong 1- 4 giờ.
(4) Nhuộm Hematoxin và Eosin: Trƣớc hết làm mất parafin bằng Xilen I trong 5 phút, Xilen II trong 5 phút. Sau đó làm no nƣớc mẫu bằng Ethanol 100% 2 - 3 phút, Etanol 95% 2 - 3 phút, Etanol 95% 2 - 3 phút, Etanol 80% 2 - 3 phút, Etanol 80% 2 - 3 phút, Etanol 50% 2 - 3 phút, mỗi nồng độ lặp lại hai lần. Nhúng trong nƣớc 3 - 6 lần.
Cuối cùng nhuộm Hematoxin - Mayer trong 4 - 6 phút, rửa qua nƣớc chảy nhẹ 4 - 6 phút và nhuộm Eosin trong 2 phút.
(5) Làm trong mẫu: Ngâm mẫu trong dung dịch Xilen I trong 2 - 3 phút, Xilen II trong 2 – 3 phút. Để khô và đậy lamen bằng keo dán Boncanada, ghi nhãn trên lamen là khâu cuối cùng.
Đọc tiêu bản các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục của cá đực và cá cái trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 40 lần. Các giai đoạn phát triển của buồng trứng đƣợc phân chia theo bậc thang phát triển của 2 tác giả Sakun & Butskaia [99].
Đƣờng kính của noãn bào, nhân đƣợc đo bằng trắc vi thị kính (micrometter) gắn trên thị kính ở vật kính 10 hoặc 40. Mỗi buồng trứng tiến hành đo trên 3 tiêu bản cắt ở ba vị trí khác nhau (đầu, giữa và cuối tuyến sinh dục). Mỗi tiêu bản đo tất cả các trứng trong ba thị trƣờng. Xác định các thị trƣờng khác nhau bằng cách di chuyển tiêu bản nhờ giá giữ và hai ốc dịch chuyển. Tùy theo kích thƣớc của trứng mà số trứng đƣợc đo trên mỗi tiêu bản dao động từ 30 - 100 trứng. Kích thƣớc của noãn bào và nhân đƣợc tính theo công thức:
L = 0,1 * (A/n)
Trong đó L: Chiều dài thực của mẫu (noãn bào) (mm) A: Số vạch trên trắc vi thị kính đếm đƣợc
n: Bội giác của vật kính
Kích thƣớc của các trứng ở mỗi pha phát triển của noãn bào đƣợc đo trên 30 trứng. Đo đƣờng kính của các hạt lipid (không bào), nang trứng cũng tƣơng tự. Hình ảnh của các tiêu bản đƣợc chụp bằng máy ảnh Olympus Camedia C7070 Wide Zoom ở độ phóng đại 100, 400, hoặc 1000.
Xác định tỷ lệ trứng ở các pha phát triển của noãn bào trong mỗi tháng bằng cách đếm số trứng của mỗi pha trên tiêu bản. Có thể đếm trực tiếp trên kính hoặc đếm trên hình ảnh chụp của các tiêu bản của các buồng trứng trong tháng. Mỗi buồng trứng sử dụng 3 tiêu bản của 3 phần đầu, giữa, cuối để đếm. Số trứng đếm và số tiêu bản dùng để đếm tƣơng tự nhƣ đo đƣờng kính của trứng.
+ Xác định tuổi tham gia sinh sản, mùa vụ và hệ số thành thục sinh dục: Tiến hành nuôi vỗ và cho đẻ cá hồi vân cái và đực ở độ tuổi 1+ và 2+. Theo dõi sự phát triển tuyến sinh dục 1 tháng/lần (5 cái và 5 đực) trong thời gian 12 tháng để xác định mùa
vụ sinh sản, kích cỡ sinh sản, tuổi sinh sản và hệ số thành thục sinh dục của cá trong điều kiện tại Lâm Đồng.