Điện di mao quản vùng là một kiểu được ứng dụng đầu tiên và phổ biến của kỹ thuật CE do tính đơn giản của các hoạt động tách và tính linh hoạt của nó.
Cơ sở tách: Dựa trên sự khác nhau về linh độ điện di của phần tử các chất trong dung dịch. Khi đặt vào hai đầu mao quản một điện thế và dòng EOF đủ lớn thì thứ tự rửa giải: cation, chất trung hòa và sau cùng là anion.[7]
Ứng dụng của CZE: CZE được ứng dụng chủ yếu để tách các chất có cấu tạo ionic (hợp chất có liên kết ion, hợp chất mà khi tan trong pha động điện di chúng có thể phân ly thành các ion âm và dương) trong nhiều lĩnh vực như: sinh hóa, dược phẩm, thực phẩm, môi trường.
Có thể thay đổi các điều kiện của CZE để mở rộng phạm vi phân tích:
- Tách các chất đồng phân đối quang bằng cách cho thêm các chất chọn lọc đối quang như cyclodextrin.
- Thực hiện đảo thế để tách các anion nhanh hơn nếu mẫu chỉ yêu cầu phân tích anion.
2.3. Phƣơng tiện nghiên cứu 2.3.1 Nguyên vật liệu
2.3.1.1. Chất chuẩn đối chiếu
- Aspartam (Sigma, hàm lượng 98,54 %)
- Axit Sorbic (Merck, hàm lượng 99,34%)
- Benzoic (Merck, hàm lượng 99,62%)
- Saccharin (Sigma, hàm lượng 99,50 %)
- Acesulfam - K (Sigma, hàm lượng 99,67%).
- Cyclamate (Sigma, hàm lượng 99,5%). - Fructose (Merck, hàm lượng 99,72%) - Glucose (Merck, hàm lượng 99,8%) - Cyclamate (Merck, hàm lượng 99,8%) - Saccharose (Merck, hàm lượng 99,62%)
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
- Brilliant Blue (Sigma, hàm lượng 99,5%) - Tartarin (Sigma, hàm lượng 99,5%) - Quinolin (Merck, hàm lượng 99,78%) - Sunset Yellow (Merck, hàm lượng 99,8%)
2.3.1.2 Hóa chất dung môi
- Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) (PA, Merck, Đức) - Kali dihydrophosphat (KH2PO4.H2O) (PA, Merck, Đức) - Dikali hydrophosphat (K2HPO4.H2O) (PA, Merck, Đức) - Natri hydroxyd (NaOH) (PA, Merck, Đức)
- Ethanol (C2H5OH) (PA, Merck, Đức) - Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức) - Axit Phophoric (H3PO4), (PA, Merck, Đức) - Methanol (Merck, hàm lượng 99,8%)
- Nước siêu tinh khiết: là nước cất 2 lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 μm.
2.3.1.3. Thiết bị dụng cụ
- Máy điện di mao quản Agilent (Mỹ) có trang bị detector UV-VIS kết nối với máy tính và máy in
Hình 2.6. Hệ thống phân tích CE: Máy điện di Agilent, máy tính, máy in
- Mao quản silica nung chảy: đường kính trong i.d = 50 μm, chiều dài tổng cộng L = 64 cm (Agilent, Mỹ) và L = 52 cm
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
- Bộ lọc nước siêu tinh khiết Elga : Model ELGASTAT MAXIMA SC áp suất tối đa 1,4 bar/20psi(bơm vào), 4,1 bar/60 psi (hoạt động), (Elga Ltd, Anh)
- Máy rung siêu âm ULTRASONIC LC30 (Elma - Đức)
- Máy đo pH Metrohm (Thuỵ Sĩ) cho kết quả đến ± 0,01 đơn vị pH - Đầu lọc có đường kính lỗ lọc d = 0,2 μm
- Cân phân tích 4 số OHAUS (Mỹ)
- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác… - Micropipet 100 ; 200 ; 1000 ; 5000 μL
-Tủ lạnh Sanyo MDF-236 (bảo quản mẫu).
2.4. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 2.4.1. Pha dung dịch chuẩn gốc 2.4.1. Pha dung dịch chuẩn gốc
Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Cyclamate, Saccharose, Glucose, Fructose, Brilliant Blue, Tartarin, Quinolin, Sunset Yellow được pha trong dung môi là nước. Axit Sorbic, Axit Benzoic hòa tan trong Methanol. Cụ thể:
-Lần1: Cân chính xác 0,0500g (Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Cyclamate ) mỗi loại đem hòa tan bằng nước cất siêu tinh khiết chuyển vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất tới vạch, sau đó đem rung siêu âm 30 phút thu được các dung dịch gốc có nồng độ là 1000ppm. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lanh dưới 100C, có thể dùng được trong 3 tháng.
-Lần 2: Cân chính xác 0,0378g Acesulfame-K, 0,0257g Saccharin, 0,0267g Aspartame, hòa tan định mức 50 ml bằng nước cất siêu tinh khiết và đem rung siêu âm thu được dung dịch gốc có nồng độ lần lượt là Ace 756 ppm, Sac 514 ppm, Asp 534 ppm.
-Lần 3: Cân chính xác 0,0269g Saccharin, 0,0303g Acesulfame-K, 0,0270g Aspartame hòa tan định mức 25 ml bằng nước cất siêu tinh khiết và đem rung siêu âm thu được dung dịch gốc có nồng độ lần lượt là Ace 1212 ppm, Sac 1076 ppm, Asp 1080 ppm.
- Chất bảo quản: Cân chính xác 0,0288g Axit Sorbic, 0,0269g Axit Benzoic hòa tan bằng dung dịch Methanol theo tỷ lệ 40 mg/1 ml Methanol rồi sau đó mới thêm nước cất siêu tinh khiết đem rung siêu âm 30 phút và định mức 25 ml bằng nước cất siêu tinh khiết được dung dịch có nồng độ Axit Sorbic 1152 ppm, Axit Benzoic 1076 ppm.
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
- Các loại đường cân chính xác 0,0261g Saccharose, 0,0269g Fructose, 0,0289 Glucose, hòa tan bằng nước cất siêt tinh khiết, định mức 25ml, đem rung siêu âm thu được các dung dịch có nồng độ Saccharose 1044 ppm, Fructose 1076 ppm, Glucose 1156 ppm.
- Phẩm màu: Cân chính xác 0,0232g Brilliant Blue, 0,0304g Tartarin, 0,0357g Quinolin, 0.0211g Sunset Yellow hòa tan bằng nước cất siêt tinh khiết, định mức 25ml, đem rung siêu âm thu được các dung dịch có nồng độ Brilliant Blue 928 ppm, Tartarin 1216 ppm, Quinolin 1428 ppm, Sunset Yellow 844 ppm.
- Từ các dung dịch chuẩn trên ta có thể các dung dịch chuẩn làm việc có các nồng độ khác nhau như dung dịch chuẩn:200; 150; 100; 80; 60; 50; 45; 35; 25; 20; 10; 5 ppm…Các dung dịch làm việc được pha hàng ngày.
2.4.2. Pha dung dịch đệm
Dung dịch đệm borat 20 mM pH 6,.00; pH 7,50; pH ,50; pH 9,00; pH 9,50; pH
10,00
+ Natri borat được sấy ở 105o C/2h + Cân 1 lượng tùy theo thể tích cần pha
+ Pha trong khoảng 80% thể tích nước: điều chỉnh về pH 8,50; pH 9,00 bằng acid HCl 1M, điều chỉnh về pH 9,50; pH 10,00 bằng NaOH 1M trên máy đo pH rồi thêm nước đủ đến vạch.
Dung dịch đệm borat 15 mM 25 mM và 30 mM cũng được pha tương tự.
Dung dịch đệm Kali phosphat 20 mM pH 7.5
+ Pha dung dịch K2HPO4 nồng độ 20 mM + Pha dung dịch KH2PO4 nồng độ 20 mM
Đo pH của dung dịch K2HPO4, thêm từ từ dung dịch KH2PO4 vào dung dịch K2HPO4 cho đến khi pH về 7.5 thì dừng lại.
Dung dịch đệm Kali phosphat 20 mM, pH 3,00
+ Pha dung dịch KH2PO4 20 mM bằng 80% thể tích nước, sau đó điều chỉnh về pH 3,00 bằng acid H3PO4 1M và thêm nước vừa đủ.
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
+ Dung dịch đệm có thể được sử dụng nhiều ngày (cụ thể: pH 3,00 dùng được trong một tháng, pH ≥ 7 dùng được trong 1 tuần), nhưng phải kiểm tra pH hàng ngày trước khi sử dụng.
Dung dịch đệm Acetat 20 mM pH 6,0
+ Pha dung dịch CH3COONa 20 mM bằng 80 % thể tích nước, sau đó điều chỉnh về pH =6,00 bằng Axit Acetic 1M và thêm nước vừa đủ.
Tất cả các dung dịch đều được pha bằng nước siêu tinh khiết, lọc qua màng lọc 0,2 μm và rung siêu âm loại khí trước khi sử dụng và đều phải được kiểm tra độ pH trước khi sử dụng
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện xác định Ace-K, Sac, Asp bằng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản.
3.1.1. Một số điều kiện cố định
- Cột mao quản: chiều dài L= 65cm, đều có đường kính trong i.d = 50 μm.
- Tiêm mẫu: áp suất 50 mbar trong thời gian 5 s với cường độ dòng điện là 50 mA. - Bước sóng phát hiện được lựa chọn dựa vào độ hấp phụ của từng chất:
+ Aspartam: 191nm + Saccharin: 202 nm + Acesulfam - K: 226 nm (a) (b) (c)
Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV – VIS của asp (a), sac (b), ace- k (c) trong môi trường nước ( L= 65cm, i.d=50 μm, áp suất 50 mbar, I = 50 mA, E = 25 kV)
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
3.1.2. Khảo sát các điều kiện 3.1.2.1. Hệ đệm 3.1.2.1. Hệ đệm
Khảo sát loại đệm và pH của đệm
Đầu tiên chúng tôi tiến hành khảo sát 3 loại đệm ở 3 vùng pH: Đệm photphat 20 mM (pH 3,00), đệm Acetat 20mM (pH 6,0), và đệm borat 20 mM (pH 9,00).
Quá trình điện di thu được kết quả ở bảng 3.1, và hình 3.3 và phụ lục 1
Bảng 3.1. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào các loại đệm
Chất chuẩn
Nồng độ (ppm)
Diện tich (mau.s)
Đệm phosphat Đệm acetat Đệm borat
Aspartame 40 38,6 24,2 22,5 Saccharin 40 4,5 115,5 152,8 Acesulfame-K 40 1,2 53,5 62,3 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Đệm phosphat pH=3 Đệm acetat pH=6 Đệm borat pH=9 D iệ n t íc h ( m a u .s ) Aspartame Saccharin Acesulfame-K
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào các loại đệm
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
Hình 3.3. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện Đệm borat 20 mM pH 9,00 ( L=65 cm, I=50 mA, V=25kV, t =25oC, áp suất 50 mbar)
Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 3.1, phụ lục 1 và hình 3.2, hình 3.3 chúng tôi nhận thấy khả năng tách của các chất phân tích ở đệm borat pH 9,00 là tốt nhất, qua sắc đồ hình 3.3 ta thấy các píc rõ ràng, cân đối và diện tích píc của các chất là lớn nhất, còn ở pH 3,00 thời gian lưu của các chất tách ra khỏi nhau là rất dài, đường nền nhiễu và dòng không ổn định, tín hiệu phát hiện các chất kém. Ở pH = 6 với đệm acetat cho tín hiệu các píc rõ dàng hơn nhưng không cân đối. Vì thế đệm borat được lựa chọn là loại đệm sẽ dùng.
Và chúng tôi tiếp tục khảo sát các điểm pH khác xung quanh điểm pH 9.00 với đệm borat 20 mM, cụ thể: pH 8,50; pH 9,50; pH 10,0. Kết quả cụ thể:
Bảng 3.2. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào giá trị pH
Chất chuẩn Nồng độ (ppm) Diện tích píc (mau.s) pH=8.5 pH=9.0 pH=9.5 pH=10 Aspartame 40 19,4 22,5 23,0 35,6 Saccharin 40 138,0 152,8 156,0 245,0 Acesulfame-K 40 51,2 62,3 64,6 42,3
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên 0 50 100 150 200 250 300 pH=8.5 pH=9.0 pH=9.5 pH=10 D iệ n tí ch ( m au .s ) Aspartame Saccharin Acesulfame-K
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc của asp, sac, ace-k vào giá trị pH của đệm borat 20 mM.
min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Norm. 0 20 40 60 80 100
DAD1 E, Sig=215,5 Ref=off (MIXDUONG HH\STD000082.D)
4 .5 36 6 .8 60 7 .5 27 pH=9.5
Hình 3.5. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất chuẩn asp, sac, ace-k trong điều kiện (Đệm borat pH 9,5, L=65 cm, I= 50mA, V= 25kV, t=25oC áp suất 50 mbar)
Nhận xét: Qua các điện di đồ ở phụ lục 2, hình 3.4, hình 3.5 và bảng 3.2 thể hiện ở trên có thể thấy khi pH hệ đệm tăng thì diện tích píc các chất đều tăng. Tại pH 10,0 diện tích píc của acesulfame-k giảm, còn saccharin diện tích píc tăng mạnh. Ở pH 9,5 các chất được tách tốt nhất, hình dáng pic cân đối, gọn nhất, đồng thời tín hiệu đường nền ổn định và diện tích píc của các chất tăng đều. Do vậy đệm borat, pH 9,5 được lựa chọn cho các bước khảo sát tiếp theo.
Khảo sát nồng độ đệm:
Sau khi lựa chọn được hệ đệm và pH của đệm chúng tôi tiếp tục khảo sát nồng độ của hệ đệm. Đối với kỹ thuật CZE thì nồng độ đệm sử dụng phải đủ lớn nếu không sẽ tạo
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
ra các vùng dẫn điện khác nhau trong mao quản. Nhưng nồng độ đệm lại tỷ lệ thuận với thời gian dịch chuyển và độ lớn của dòng điện trong mao quản. Nên cần lựa chọn hệ đệm có nồng độ thích hợp. Cụ thể nồng độ đệm borat pH 9.5 như sau: 15 mM, 20 mM, 25mM, 30mM.
Bảng 3.3. Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất chuẩn vào nồng độ đệm borat
Chất chuẩn
Nồng độ (ppm)
Thời gian lưu ( phút)
15 mM 20 mM 25 mM 30 mM Aspartame 40 4,471 4,589 4,777 6,289 Saccharin 40 6,496 6,812 7,412 8,465 Acesulfame-K 40 7,013 7,413 8,171 10,106 0 2 4 6 8 10 12 15 mM 20 mM 25 mM 30 mM Nồng độ đệm borat pH 9.5 Th ờ i g ia n lư u (p hú t) Aspartame Saccharin Acesulfame-K
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu của asp, sac, ace-k vào nồng dộ đệm borat pH 9,5
Hình 3.7. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện đệm borat 20 mM ( pH 9,5 và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, t =25oC, áp suất 50 mbar)
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên Nhận xét: Qua các điện di đồ ở phụ lục 3 và hình 3.6, hình 3.7 ta thấy các chất đều được phát hiện và tách tốt. Trong đó thời gian lưu của 3 chất chuẩn khi sử dụng đệm borat 15 mM là ngắn nhất. Mặt khác khi sử dụng đệm 30 mM với điện thế áp vào 2 đầu mao quản là 25 kV thì cường độ dòng điện lên tới 100μA, làm cho đường nền nhiễu hơn so với trường hợp sử dụng đệm có nồng độ 20 mM, đồng thời. Trên hình 3.4 ở nồng độ đệm borat 20 mM cho píc đều cân xứng, thời gian lưu ngắn , hơn nữa diện tích píc các chất là lớn nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn đệm borac nồng độ 20 mM, pH 9,5 cho các bước tiếp theo.
3.1.2.2. Xác định điều kiện nhiệt độ
Sau khi chọn được hệ đệm thích hợp là: đệm borat 20 mM, pH 9,5 ta xét đến sự thay đổi của nhiệt độ đối với quá trình tách các chất trong hỗn hợp. Tiến hành khảo sát ở các nhiệt độ: 20o
C, 25oC, và 30oC. Kết quả như sau:
Bảng 3.4. Kết quả thời gian lưu của asp, sac, ace-k ở các nhiệt độ khác nhau
Chất chuẩn Nồng độ (ppm)
Thời gian lưu (phút)
Nhiệt độ 20oC Nhiệt độ 25oC Nhiệt độ 30oC
Aspartame 40 4,987 4,589 3,957 Saccharin 40 7,195 6,812 5,723 Acesulfame-K 40 7,826 7,419 6,255 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Nhiệt độ 20oC Nhiệt độ 25oC Nhiệt độ 30oC
Th ờ i g ia n lư u (p hú t) Aspartame Saccharin Acesulfame-K
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu của asp, sac, ace-k vào nhiệt độ
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
Hình 3.9. Điện di đồ của hỗn hợp asp, sac, ace-k ở nhiệt độ 25oC trong điều kiện ( Đệm borat 20 mM, pH 95, và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, áp suất 50 mbar)
Nhận xét: Qua sự khảo sát trên ta thấy tại 25oC các chất tách khỏi nhau, pic cân đối và gọn (hình 3.9). Còn ở nhiệt độ 30oC thời gian tách các chất tuy nhanh hơn nhưng đường nền không đẹp và sẽ làm tăng hiệu ứng nhiệt. Ở nhiệt độ 20oC thời gian tách các chất lâu hơn so với 25oC và 30oC (phụ lục 4). Điều này cho thấy khi nhiệt độ thay đổi thì độ nhớt cũng thay đổi theo, và qua đó ảnh hưởng đến giá trị độ điện di của chất tan ( chất phân tích ), chúng sẽ gây ra sự mở rộng píc. Tức là làm giảm hiệu quả tách. Vì khi độ nhớt thay đổi sẽ làm cho số đĩa hiệu lực N ef của cột tách giảm theo. Hơn nữa với điều kiện khí hậu nước ta việc duy trì nhiệt độ mao quản ở 25oC là thích hợp.Vì vậy chúng tôi lựa chọn điều kiện nhiệt độ chạy sắc ký là 25oC.
3.1.2.3. Xác định thế đặt vào hai đầu
Trong phương pháp điện di, điện thế áp vào hai đầu mao quản là một nhân tố chính quyết định đến quá trình phân tích. Vì thế trong quá trình sắc ký một hỗn hợp mẫu, để có kết quả tốt và ổn định, chúng ta chúng ta phải chọn giá trị thế thích hợp nhất, khống chế và giữ cho giá trị thế V này luôn không đổi để có được giá trị E và dòng điện I cũng không đổi. Vì vậy điện thế được chúng tôi lựa chọn để khảo sát là 20 kV, 25 kV và 30 kV. Kết quả thu được như sau:
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên Bảng 3.5. Thời gian lưu của asp, sac, ace-k khi thay đổi điện thế
Chất chuẩn Nồng độ (ppm)
Thời gian lưu (phút)
V = 20 kV V = 25 kV V = 30 kV Aspartame 40 4,723 4,589 3,915 Saccharin 40 7,156 6,812 5,720 Acesulfame-K 40 7,705 7,419 6,201 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 V = 20 kV V = 25 kV V = 30 kV Điện thế (kV) Th ờ i g ia n l ư u ( p h ú t) Aspartame Saccharin Acesulfame-K
Hình 3.10. Đồ thị biểu diện sự phụ thuộc giữa thời gian lưu của asp, sac, ace-k vào điện thế
Nhận xét: Từ kết quả khảo sát ở các giá trị điện thế 20 kV, 25 kV, 30 kV cho kết quả ở bảng 3.5, hình 3.10 và phụ lục 5 cho thấy. Ở điện thế 30 kV thời gian phân tích tốt nhưng dòng điện tạo ra cao( lớn hơn 100 µA), vì khi dòng điện i lớn sẽ gây ra hiệu ứng