Điện di mao quản có nhiều kiểu khác nhau, nhưng tùy theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy ra trong ống mao quản mà có thể phân chia thành các loại hay các kiểu điện di với các tên gọi riêng khác nhau. [7] Cụ thể như sau:
1. Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE).
2. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE), cơ chế tách: Linh độ khác nhau của các chất (phụ thuộc điện tích và kích cỡ ion).
3. Sắc ký điện di mao quản điện động học Mixen (Micellary Capillary Electro- Kenetic Chromatogrphy: MEKC hay MCEKC), cơ chế tách là: Tương tác phân cực/không phân cực hạt mixen trong dung dịch và linh độ của chất.
4. Sắc ký điện di mao quản gel (rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis Chromatography: Gel-CEC), cơ chế tách là dựa vào linh độ của chất và tương tác các loại cỡ hạt với hạt gel.
5. Sắc ký điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing Chromatography: CIEFC).
6. Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis Chromatography: CITPC).
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
Trong đó điện di mao quản vùng (CZE) là kiểu điện di đơn giản nhất, được sử dụng rất rộng dãi. Đây cũng là kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu của luận văn này.
2.2.2.5. Mao quản (cột tách) trong phƣơng pháp điện di mao quản
Mao quản chính là cột tách, một bộ phận quan trọng trong điện di mao quản. Đây là một trong các yếu tố chính quyết định sự điện di của hỗn hợp chất mẫu. Mao quản được chế tạo chủ yếu bằng silica, được gọi là mao quản silica. Trong một số trường hợp người ta cũng dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp, ví dụ mẫu có iôn F-
và tách ở pH thấp.
Hình 2.2. Mặt cắt ngang của mao quản
Mao quản trong CE thường có đường kính trong (ID) từ 25 đến 150 m và có thành dày từ 80-120 m. Còn chiều dài của mao quản là tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách. Nhìn chung, hiện nay hay được dùng là các mao quản có tổng chiều dài (Ltot) từ 30 đến 120 cm, với chiều dài hiệu dụng (Leff) từ 20 đến 100 cm. Tuy nhiên, cũng có trường hợp hai chiều dài này có giá trị bằng nhau (Ltot = Leff) như đối với đêtectơ khối phổ (MS). Mao quản được làm bằng silica, phủ bên ngoài một lớp polyme (ví dụ polyimit, PVC) có độ dày từ 200 đến 350 m, làm cho mao quản có độ dẻo, có thể uốn lại được mà không gãy (tương tự như cột mao quản trong sắc ký khí). Tuy nhiên, chính lớp polyme này lại làm cho mao quản có nhược điểm là sự truyền nhiệt từ trong mao quản ra môi trường bên ngoài kém đi, ảnh hưởng đến quá trình điện di.[6]
2.2.2.6. Dòng điện thẩm (Electroosmotic flow-EOF)
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 2.3. Cấu trúc lớp điện kép trên thành mao quản
Hình 2.4. Dòng EOF và lớp điện kép trong mao quản
Nguồn gốc
Bề mặt bên trong thành mao quản chứa nhóm silanol (Si-OH). Tùy theo pH của dung dịch đệm điện li mà bề mặt thành mao quản có thể tích điện âm hay dương. Khi dung dịch đệm có pH ≥ 3 thì nhóm silanol sẽ bị ion hoá thành silanoat (SiO-). Ở phần thực nghiệm, chúng tôi đều sử dụng đệm có pH ≥ 3 vì thế dưới đây chúng tôi sẽ trình bày sự hình thành EOF khi bề mặt mao quản tích điện âm.
Khi bề mặt đã có điện tích, thì các nhóm silanoat sẽ hút các cation của dung dịch đệm và hình thành một lớp cation trên bề mặt trong thành mao quản. Do mật độ các
Lớp khuếch tán Lớp điện kép Chiều dày lớp điện kép Khoảng cách (nm)
Thành mao quản silica với nhóm silanol
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
cation này không đủ trung hoà các nhóm silanoat nên sẽ hình thành thêm một lớp cation linh động thứ hai.
[6] Khi đặt vào hai đầu mao quản một điện thế, dưới tác dụng của lực điện trường lớp cation linh động thứ hai sẽ di chuyển về phía cathod. Còn các anion sẽ hướng về phía anod. Vì các cation này bị solvat hoá do đó sẽ lôi kéo các chất trong dung dịch đệm di chuyển cùng và hình thành dòng EOF. Nếu tốc độ của các anion nhỏ hơn tốc độ của EOF, thì nó sẽ bị dòng EOF kéo đi. Khi đó cả cation và anion đều nằm trong dòng chảy khối.
Đặc điểm của dòng EOF [7]
Khác với dòng thủy động lực ở sắc ký, trong CE, dòng EOF có thiết diện gần như phẳng nên sự phân tán của vùng mẫu là nhỏ nhất và như thế chúng ta thu được pic các chất là gọn và sắc nét (hình 2.5).
Đưa tất cả các phần tử chất tan trong dung dịch di chuyển theo cùng một hướng khi dòng EOF đủ lớn.
Hình 2.5. Các kiểu dòng chảy và pic sắc ký trong CE.
A- Kiểu dòng chảy không có áp suất (dòng EOF); B- Kiểu dòng chảy có áp suất (dòng Laminar)
Kiểm soát EOF (duy trì, thay đổi độ lớn, đổi chiều):
Thường thông qua xem xét và thay đổi các yếu tố liên quan sau:
- Các chất đệm, chất điện giải, thành phần pha động điện di và pH của nó - Điện thế đặt vào hai đầu mao quản
- Nhiệt độ mao quản trong quá trình điện di
- Mao quản, các đặc trưng và tính chất bề mặt của nó - Chất phụ gia.
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
2.2.2.7. Các thông số phân tích của CE
Tốc dộ dịch chuyển . . i i i V v E L
L: Chiều dài tổng cộng của mao quản (cm) μi: linh độ điện di toàn phần của ion (cm2/V.s) E: điện trường trong mao quản do thế V sinh ra. Thời gian dịch chuyển (Migration time, tm):
Thời gian dịch chuyển là thời gian một chất bắt đầu đi vào mao quản cho đến khi chất đó đi qua detector (xuất hiện pic trên điện di đồ).
m i l t v
l: chiều dài hiệu dụng của mao quản (cm).
Thời gian dịch chuyển là thông số có thể dùng để định tính trong CE. Số đĩa lý thuyết:
Hiệu lực cột được thể hiện bằng số đĩa lý thuyết:
16 N ( w tm )2 5,54( 2 / 1 w tm )2 N: số đĩa lý thuyết
W: chiều rộng đáy pic
W1/2: chiều rộng của pic đo ở ½ chiều cao. Độ phân dải:
Độ phân dải giữa 2 pic cạnh nhau là một đại lượng trong thực tế thường được dùng chỉ chất lượng của một quá trình tách. Nếu R > 1,5 là có độ phân giải tốt.
2 s R 2 1 1 2 ( ) ( ) t t w w
t1: thời gian dịch chuyển của chất thứ nhất (phút)
t2: thời gian dịch chuyển của chất thứ hai (phút) (t2 > t1) w1: độ rộng đáy pic thứ nhất
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
2.2.2.8. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình điện di
Dung dịch đệm
- pH dung dịch đệm - Thành phần hệ đệm - Nồng độ dung dịch đệm
- Độ nhớt , hằng số điện môi của dung dịch đệm Điện thế nguồn
Dòng EOF và tốc độ điện di tỷ lệ thuận với độ lớn của điện thế. Tuy nhiên thế quá cao sẽ dẫn đến tăng tăng hiệu ứng nhiệt Jun và thời gian phân tích quá ngắn sẽ làm giảm độ phân giải, thậm chí chưa kịp phát hiện ra chất phân tích.
Mao quản
- Kích thước (chiều dài, đường kính, độ dày thành) của ống mao quản - Loại mao quản và bề mặt mao quản
- Nếu mao quản có nhồi pha tĩnh xốp thì loại pha tĩnh, kích thước, cỡ hạt và độ xốp của nó cũng góp phần ảnh hưởng đến sự tách của các chất phân tích.
Lượng mẫu, kỹ thuật và điều kiện nạp mẫu vào mao quản.
Các chất phụ gia thêm vào pha động điện di hoặc vào mẫu phân tích
Trên đây là các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tách các chất trong mao quản. Ngoài ra còn có các yếu tố về trang thiết bị phát hiện chất phân tích.
2.2.2.9. Các loại detector thông dụng trong phƣơng pháp điện di mao quản
Detector là bộ phận quan trọng quyết định đến độ nhạy của phương pháp phân tích; tuỳ thuộc bản chất lý hoá của chất phân tích mà chúng ta đưa ra lựa chọn detector phù hợp [7]:
- Detector UV-VIS - Detector huỳnh quang - Detector khối phổ.
- Detector UV-VIS với diode Array - Detector độ dẫn….
Ngày nay các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như: diot-aray, MS, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kỹ thuật tin học phát
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích.
2.2.2.10. Điện di mao quản vùng (CZE)
Điện di mao quản vùng là một kiểu được ứng dụng đầu tiên và phổ biến của kỹ thuật CE do tính đơn giản của các hoạt động tách và tính linh hoạt của nó.
Cơ sở tách: Dựa trên sự khác nhau về linh độ điện di của phần tử các chất trong dung dịch. Khi đặt vào hai đầu mao quản một điện thế và dòng EOF đủ lớn thì thứ tự rửa giải: cation, chất trung hòa và sau cùng là anion.[7]
Ứng dụng của CZE: CZE được ứng dụng chủ yếu để tách các chất có cấu tạo ionic (hợp chất có liên kết ion, hợp chất mà khi tan trong pha động điện di chúng có thể phân ly thành các ion âm và dương) trong nhiều lĩnh vực như: sinh hóa, dược phẩm, thực phẩm, môi trường.
Có thể thay đổi các điều kiện của CZE để mở rộng phạm vi phân tích:
- Tách các chất đồng phân đối quang bằng cách cho thêm các chất chọn lọc đối quang như cyclodextrin.
- Thực hiện đảo thế để tách các anion nhanh hơn nếu mẫu chỉ yêu cầu phân tích anion.
2.3. Phƣơng tiện nghiên cứu 2.3.1 Nguyên vật liệu
2.3.1.1. Chất chuẩn đối chiếu
- Aspartam (Sigma, hàm lượng 98,54 %)
- Axit Sorbic (Merck, hàm lượng 99,34%)
- Benzoic (Merck, hàm lượng 99,62%)
- Saccharin (Sigma, hàm lượng 99,50 %)
- Acesulfam - K (Sigma, hàm lượng 99,67%).
- Cyclamate (Sigma, hàm lượng 99,5%). - Fructose (Merck, hàm lượng 99,72%) - Glucose (Merck, hàm lượng 99,8%) - Cyclamate (Merck, hàm lượng 99,8%) - Saccharose (Merck, hàm lượng 99,62%)
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
- Brilliant Blue (Sigma, hàm lượng 99,5%) - Tartarin (Sigma, hàm lượng 99,5%) - Quinolin (Merck, hàm lượng 99,78%) - Sunset Yellow (Merck, hàm lượng 99,8%)
2.3.1.2 Hóa chất dung môi
- Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) (PA, Merck, Đức) - Kali dihydrophosphat (KH2PO4.H2O) (PA, Merck, Đức) - Dikali hydrophosphat (K2HPO4.H2O) (PA, Merck, Đức) - Natri hydroxyd (NaOH) (PA, Merck, Đức)
- Ethanol (C2H5OH) (PA, Merck, Đức) - Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức) - Axit Phophoric (H3PO4), (PA, Merck, Đức) - Methanol (Merck, hàm lượng 99,8%)
- Nước siêu tinh khiết: là nước cất 2 lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 μm.
2.3.1.3. Thiết bị dụng cụ
- Máy điện di mao quản Agilent (Mỹ) có trang bị detector UV-VIS kết nối với máy tính và máy in
Hình 2.6. Hệ thống phân tích CE: Máy điện di Agilent, máy tính, máy in
- Mao quản silica nung chảy: đường kính trong i.d = 50 μm, chiều dài tổng cộng L = 64 cm (Agilent, Mỹ) và L = 52 cm
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
- Bộ lọc nước siêu tinh khiết Elga : Model ELGASTAT MAXIMA SC áp suất tối đa 1,4 bar/20psi(bơm vào), 4,1 bar/60 psi (hoạt động), (Elga Ltd, Anh)
- Máy rung siêu âm ULTRASONIC LC30 (Elma - Đức)
- Máy đo pH Metrohm (Thuỵ Sĩ) cho kết quả đến ± 0,01 đơn vị pH - Đầu lọc có đường kính lỗ lọc d = 0,2 μm
- Cân phân tích 4 số OHAUS (Mỹ)
- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác… - Micropipet 100 ; 200 ; 1000 ; 5000 μL
-Tủ lạnh Sanyo MDF-236 (bảo quản mẫu).
2.4. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 2.4.1. Pha dung dịch chuẩn gốc 2.4.1. Pha dung dịch chuẩn gốc
Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Cyclamate, Saccharose, Glucose, Fructose, Brilliant Blue, Tartarin, Quinolin, Sunset Yellow được pha trong dung môi là nước. Axit Sorbic, Axit Benzoic hòa tan trong Methanol. Cụ thể:
-Lần1: Cân chính xác 0,0500g (Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Cyclamate ) mỗi loại đem hòa tan bằng nước cất siêu tinh khiết chuyển vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất tới vạch, sau đó đem rung siêu âm 30 phút thu được các dung dịch gốc có nồng độ là 1000ppm. Dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lanh dưới 100C, có thể dùng được trong 3 tháng.
-Lần 2: Cân chính xác 0,0378g Acesulfame-K, 0,0257g Saccharin, 0,0267g Aspartame, hòa tan định mức 50 ml bằng nước cất siêu tinh khiết và đem rung siêu âm thu được dung dịch gốc có nồng độ lần lượt là Ace 756 ppm, Sac 514 ppm, Asp 534 ppm.
-Lần 3: Cân chính xác 0,0269g Saccharin, 0,0303g Acesulfame-K, 0,0270g Aspartame hòa tan định mức 25 ml bằng nước cất siêu tinh khiết và đem rung siêu âm thu được dung dịch gốc có nồng độ lần lượt là Ace 1212 ppm, Sac 1076 ppm, Asp 1080 ppm.
- Chất bảo quản: Cân chính xác 0,0288g Axit Sorbic, 0,0269g Axit Benzoic hòa tan bằng dung dịch Methanol theo tỷ lệ 40 mg/1 ml Methanol rồi sau đó mới thêm nước cất siêu tinh khiết đem rung siêu âm 30 phút và định mức 25 ml bằng nước cất siêu tinh khiết được dung dịch có nồng độ Axit Sorbic 1152 ppm, Axit Benzoic 1076 ppm.
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
- Các loại đường cân chính xác 0,0261g Saccharose, 0,0269g Fructose, 0,0289 Glucose, hòa tan bằng nước cất siêt tinh khiết, định mức 25ml, đem rung siêu âm thu được các dung dịch có nồng độ Saccharose 1044 ppm, Fructose 1076 ppm, Glucose 1156 ppm.
- Phẩm màu: Cân chính xác 0,0232g Brilliant Blue, 0,0304g Tartarin, 0,0357g Quinolin, 0.0211g Sunset Yellow hòa tan bằng nước cất siêt tinh khiết, định mức 25ml, đem rung siêu âm thu được các dung dịch có nồng độ Brilliant Blue 928 ppm, Tartarin 1216 ppm, Quinolin 1428 ppm, Sunset Yellow 844 ppm.
- Từ các dung dịch chuẩn trên ta có thể các dung dịch chuẩn làm việc có các nồng độ khác nhau như dung dịch chuẩn:200; 150; 100; 80; 60; 50; 45; 35; 25; 20; 10; 5 ppm…Các dung dịch làm việc được pha hàng ngày.
2.4.2. Pha dung dịch đệm
Dung dịch đệm borat 20 mM pH 6,.00; pH 7,50; pH ,50; pH 9,00; pH 9,50; pH
10,00
+ Natri borat được sấy ở 105o C/2h + Cân 1 lượng tùy theo thể tích cần pha
+ Pha trong khoảng 80% thể tích nước: điều chỉnh về pH 8,50; pH 9,00 bằng acid HCl 1M, điều chỉnh về pH 9,50; pH 10,00 bằng NaOH 1M trên máy đo pH rồi thêm nước đủ đến vạch.
Dung dịch đệm borat 15 mM 25 mM và 30 mM cũng được pha tương tự.
Dung dịch đệm Kali phosphat 20 mM pH 7.5
+ Pha dung dịch K2HPO4 nồng độ 20 mM + Pha dung dịch KH2PO4 nồng độ 20 mM
Đo pH của dung dịch K2HPO4, thêm từ từ dung dịch KH2PO4 vào dung dịch K2HPO4 cho đến khi pH về 7.5 thì dừng lại.
Dung dịch đệm Kali phosphat 20 mM, pH 3,00
+ Pha dung dịch KH2PO4 20 mM bằng 80% thể tích nước, sau đó điều chỉnh về pH 3,00 bằng acid H3PO4 1M và thêm nước vừa đủ.
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
+ Dung dịch đệm có thể được sử dụng nhiều ngày (cụ thể: pH 3,00 dùng được trong một tháng, pH ≥ 7 dùng được trong 1 tuần), nhưng phải kiểm tra pH hàng ngày trước khi sử dụng.
Dung dịch đệm Acetat 20 mM pH 6,0
+ Pha dung dịch CH3COONa 20 mM bằng 80 % thể tích nước, sau đó điều chỉnh về pH =6,00 bằng Axit Acetic 1M và thêm nước vừa đủ.
Tất cả các dung dịch đều được pha bằng nước siêu tinh khiết, lọc qua màng lọc 0,2 μm và rung siêu âm loại khí trước khi sử dụng và đều phải được kiểm tra độ pH trước khi sử dụng
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện xác định Ace-K, Sac, Asp bằng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản.
3.1.1. Một số điều kiện cố định
- Cột mao quản: chiều dài L= 65cm, đều có đường kính trong i.d = 50 μm.
- Tiêm mẫu: áp suất 50 mbar trong thời gian 5 s với cường độ dòng điện là 50 mA. - Bước sóng phát hiện được lựa chọn dựa vào độ hấp phụ của từng chất:
+ Aspartam: 191nm + Saccharin: 202 nm + Acesulfam - K: 226 nm (a) (b) (c)
Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV – VIS của asp (a), sac (b), ace- k (c) trong môi trường nước ( L= 65cm, i.d=50 μm, áp suất 50 mbar, I = 50 mA, E = 25 kV)
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
3.1.2. Khảo sát các điều kiện 3.1.2.1. Hệ đệm