1.4.1. Cơ sở khoa học của biện pháp nhân giống vô tính bằng phƣơng pháp in vitro
Tế bào là đơn vị sinh lý của sinh vật. Vì vậy ở các sinh vật đơn bào sống độc lập, tất cả các chức năng đều tập trung ở trong tế bào duy nhất ấy. Tế bào ấy có tính toàn năng, nghĩa là có khả năng sống và phát triển. Đối với một cây nguyên vẹn (một sinh vật đa bào) thì nguồn gốc của nó cũng khởi đầu từ một tế bào duy nhất, đó là hợp tử hay trứng. Mặc dù phát triển từ một hợp tử, nhƣng khi nó phân chia và chuyên hoá thành mô, các cơ quan thì các tế bào ấy lại trở lên khác nhau về hình dạng và chức vụ. Trong trƣờng hợp này các tế bào đó không biểu hiện đƣợc tính toàn năng vì chúng chịu ảnh hƣởng từ các tế bào khác. Nếu ảnh hƣởng ấy bị vô hiệu hoá thì mỗi tế bào lại hoạt động nhƣ một tế bào non trẻ, nghĩa là phân chia, tăng trƣởng tạo ra cơ quan và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Nhƣ vậy, khi tách tế bào ra khỏi cơ thể một sinh vật đa bào thì tế bào ấy có khả năng sinh sống và sinh sản hay không? Để trả lời câu hỏi này, nhiều nhà khoa học đã tách tế bào ra khỏi cơ thể đa bào và nuôi trong môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo. Phƣơng pháp in vitrro bắt đầu từ phƣơng pháp nuôi cấy tế bào này. Hiện nay phƣơng pháp nhân giống này đã đƣợc áp dụng nhiều trên loại cây trồng trong đó có hoa lan. Đây là phƣơng pháp duy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 32
nhất hiện nay có thể nhân giống lan trên quy mô công nghiệp, các cây con đƣợc sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố, mẹ ban đầu [22], [25]. 1.4.2. Một số nghiên cứu tiêu biểu
Geroges Morel(1956) đã nghiên cứu thành công phƣơng pháp NCMTB của cây lan. Phƣơng pháp này đã công bố trên tạp chí A. O. S (American Orchid Society, 1960) và giống lan đầu tiên Morel áp dụng là Cymbidium.
Năm 1963, Donol E. Vimbex cũng nghiên cứu thành công trên giống
Cymbidium nhƣng lại nuôi cấy mô phân sinh đỉnh trên môi trƣờng lỏng [37]. Năm 1996, Yonco Sagaw và T .Shoji nuôi cấy mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên của Cymbidium trên cùng một lúc hai môi trƣờng lỏng và đặc. Nhƣ vậy, giống địa lan (Cymbidium) là nền tảng cho việc nhân giống bằng in vitro. Khả năng ứng dụng dễ thấy nhất của phƣơng pháp in vitro là nhân nhanh giống và phục tráng giống trong cây trồng. Morel (1960) đã nhận thấy Meristem của một loài địa lan có rất ít hoặc không có virus. Đồng thời ông cũng thành công trong kỹ thuật tạo protocorm khi nuôi cấy Meristem, các protocorm đƣợc cắt và nuôi cấy tiếp tục sẽ thu đƣợc các protocorm mới. Nếu trong điều kiện nhất định, nó sẽ hình thành các cây địa lan con mới và là những cây sạch virus.
Ở nƣớc ta, năm 1999 có Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên, Phùng Thị Thanh Thuỷ, Lê Đức Thảo nghiên cứu về loài Hạc Đính Nâu. Năm 2001 Phạm Thị Liên đã nghiên cứu đánh giá và phát triển một số giống địa lan miền Bắc [16].
Hiện nay đã có nhiều Viện nghiên cứu, Sở KH&CN của nhiều tỉnh nhƣ: Lạng Sơn, Nghệ An, Nam Định…đã xây dựng các phòng NCMTB. Tại các Viện nghiên cứu hình thành những quy trình nhân giống hoàn chỉnh với những cây trồng cụ thể để chuyển giao cho các đơn vị, địa phƣơng, đồng thời tham gia sản xuất lƣợng cây giống nhất định phục vụ kịp thời cho sản xuất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 33
Tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Đại học Nông nghiệp Hà Nội là nơi nghiên cứu đầu tiên về hoa lan. Năm 2005, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga xây dựng quy trình nhân nhanh một số giống địa lan bản địa bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào [22].
1.4.3. Quy trình kỹ thuật về in vitro
Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bƣớc:
Bƣớc 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trƣớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn then các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cấn phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trƣởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trƣờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trƣớc khi lấy mẫu cấy sẽ làmm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm tăng khả năng sống và sinh trƣởng của mẫu in vitro
Bƣớc 1: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn , đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá… chồi ngọn, chồi nách đƣợc sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc ..ở súp lơ thì dùng hoa tự non , ở bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro. Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể đƣợc sử dụng làm mẫu cấy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 34
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lƣợng thông qua con đƣờng : hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vấn đề này phải xác định đƣợc môi trƣờng và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trƣờng có nhiều xitokynin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thƣờng là 25- 270C và 16 giờ chiếu sáng/ ngày, cƣờng độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tƣợng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôI cấy khác nhau: nhanh suplơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ ngày, nhân nhanh phong lan
phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối [29].
Bƣớc 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh sang môi trƣờng tạo rễ thƣờng đƣợc bổ sung một lƣợng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trƣờng nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trƣờng không chứa chất điều tiết sinh trƣởng
Bƣớc 4: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trƣởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt đƣợc những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễ, chiều cao cây)
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nƣớc
+ Phải chủ động điều chỉnh đƣợc ẩm độ, sự chiếu sáng của vƣờn ƣơm cũng nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp [22].
1.4.4. Các vấn đề cần quan tâm trong nhân giống in vitro
Tính bất định về mặt di truyền (genetic in stability)
Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất (Tue- to-type) với số lƣợng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp phƣơng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 35 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
pháp này cũng tạo ra những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh. Trong thực tế ở Việt Nam, khi nhân giống dứa in vitro ở quy mô lớn, nếu cấy chuyển quá nhiều lần (trên 5 lần) sẽ xuất hiện nhiều biến dị. Tỉ lệ cây biến dị tăng tỉ lệ thuận với thời gian cấy chuyển tiếp sau đấy và có thể đạt tới 5%. Dạng biến dị phổ biến là bạch tạng, sọc lá, sinh trƣởng của cây bất thƣờng, hệ số nhân in vitro cũng giảm sút. Nhiều cây khi trồng trên đồng ruộng có số lá trên 100 lá vẫn chƣa ra hoa kết quả trong khi cây bình thƣờng có thể xử lý ra hoa khi cây có mặt 40 lá.
Sự nhiễm mẫu (explantcontamination)
Các vi sinh vật nhƣ nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mẫu đƣa vào nuôi cấy. Tuy nhiên một số loại vi khuẩn nhƣ:
Agrobacterium, Bacillus, corylabactorium, Erwinnia và Pscudomnas có thể xâm nhập vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1 – 2 tuần nuôi cấy). Để khắc phục đƣợc hiện tƣợng trên, trƣớc hết cần phải lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tƣợng nhiễm khuẩn và nấm mốc. Nhƣng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có phản ứng lên kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất kháng sinh thƣờng gây ra những huỷ hoại ở ti thể và lạp thể nên có ảnh hƣởng đến di truyền tế bào chất
Sự tiết độc tố từ mẫu cấy (Toxic compounds)
Trong nuôi cấy mô thƣờng quan sát thấy hiện tƣợng hoá nâu hay đen mẫu, mẫu này có thể khuyếch tán trong môi trƣờng. Hiện tƣợng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất Tanin hoặc Hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol: encomicaxit và tyramine đã làm hoá nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôicấy. Các phƣơng pháp phòng trừ sự hoá nâu:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 36
+ Bổ sung than hoạt tính vào môi trƣờng nuôi cấy (0,1 - 0,3%) phƣơng pháp này đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và
Aerides. Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trƣởng và dinh dƣỡng cần thiết khác. + Bổ sung Polyvinyl Pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt . + Sử dụng mô non gây vết thƣơng nhỏ nhất khi khử trùng.
+ Ngâm mẫu vào dung dịch Ascorbic và citric vài giờ trƣớc khi cấy. + Nuôi cấy mẫu trong môi trƣờng lỏng oxi thấp, không có ánh sáng (1 – 2 tuần).
+ Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trƣờng tƣơi trong 1 - 2 tuần
Hiện tƣợng thuỷ tinh hoá (vitri fication, Hyperhy dricity)
Trong quá trình nhân nhanh invitro thƣờng xuất hiện hiện tƣợng cây bị “thuỷ tinh hoá” – thân lá cây mọng nƣớc, trong suốt, cây rất khó sống khi đƣa ra ngoài môi trƣờng do bị mất nƣớc rất mạnh. Hiện tƣợng này thƣờng xảy ra khi nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng hay môi trƣờng ít aga, sự trao đổi khí thấp. Cây bị thuỷ tinh hoá thƣờng có hàm lƣợng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nƣớc. Cây in vitro thƣờng có mật độ khí khổng cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi cấy nên khi đƣa ra môi trƣờng tự nhiên dễ mất nƣớc. Để khắc phục hiện tƣợng thuỷ tinh hoá có thể tiến hành một số giải pháp:
+ Giảm sự hút nƣớc của cây bằng cách tăng nồng độ đƣờng hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao
+ Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trƣờng + Giảm sự sản sinh ethylene trong bình nuôi cấy
+ Xử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trƣởng + Tăng cƣờng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi [22].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 37
1.4.5. Một số kỹ thuật trồng và chăm sóc cây Địa lan nhân giống bằng in vitro Tuy việc trồng lan trên thực tế không khó khăn lắm, nhƣng lan là một loài hoa phát triển theo một nhịp điệu nghiêm ngặt trong đời sống của nó. Đối với cây con sau giai đoạn ống nghiệm, dù là từ gieo hạt hay từ nuôi cấy mô, cho đến khi trƣởng thành, chỉ cần chúng ta xử lý sai trong mỗi giai đoạn phát triển của nó hay nói một cách khác là không phù hợp với sinh lý, sinh thái của nó có thể làm cho chúng chết hàng loạt, hoặc chậm lớn, chậm ra hoa, thậm chí không ra hoa.
Cây lan sau khi đã đƣợc nhân nhanh bằng phƣơng pháp in vitro sẽ đƣợc đƣa ra vƣờn ƣơm. Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dƣỡng sang trạng thái sống hoàn toàn tự dƣỡng do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp để cây con có thể phát triển tốt nhất [19].
Giai đoạn lấy từ trong ống nghiệm ra
Đây là thời điểm mà ngƣời ta thƣờng ít chú ý. Nhƣng nếu không làm cẩn thận, nó có thể ảnh hƣởng xấu đến việc phát triển của cây con sau này.
Việc lấy cây con ra phải thật nhẹ nhàng, tránh làm dập lá, gẫy rễ, nhất là trong lúc rửa sạch hết thạch của môi trƣờng dinh dƣỡng còn bám vào rễ. Đối với các giống nhƣ Vanda, rễ to, cây cứng, làm sạch thạch dễ dàng hơn đối với những cây quá mảnh mai nhƣ Cymbidium, Dendrobium …
Đối với rễ của Cymbidium trong ống nghiệm có lông bám khá chắc thạch của môi trƣờng dinh dƣỡng và rễ thƣờng đan với nhau nên phải tỉ mẩn, cẩn thận. Phải rửa thật sạch thạch, tách riêng từng cây và loại bỏ những mô callus còn sót nếu không cây sẽ bị nhiễm khuẩn khi đƣa ra ƣơm trong vƣờn [25].
Sau khi rửa sạch cây, dùng nƣớc sạch có pha thêm một ít thuốc trừ nấm, thuốc sát khuẩn với nồng độ loãng (khoảng 1g/lít) nhúng cây con vào mục đích để trừ nấm hại cây con khi cây còn quá mảnh mai, yếu ớt [25].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 38
Cần phân loại cây to nhỏ khác nhau ra ngay trong thời gian rửa cây để khi trồng đƣợc dễ dàng và khi chăm sóc cây con đƣợc thuận lợi hơn.
Giai đoạn ở trong chậu chung
Giai đoạn ở trong chậu chung là giai đoạn khó khăn và quan trọng nhất của việc trồng cây lan con. Rebecca Tyson Northen (nhà trồng lan ngƣời Mỹ) trong cuốn “Home Orchid Growing” (1974) chỉ dẫn nhƣ sau:
Lan con lấy từ ống nghiệm ra đƣợc cho vào dung dịch sát khuẩn, sau dùng kẹp để gắp cây con vào trồng trong chậu chung. Chất liệu trồng là ba phần vỏ thông xay nhuyễn, với một phần cát, hoặc tám phần Osmunda (một chất liệu nhƣ rễ dớn của ta) xay nhuyễn, một phần cát và một phần than vụn. Tất cả chất liệu này đều đƣợc luộc kỹ để diệt nấm và diệt trùng.
Pha loãng dung dịch phân bón, một phần tƣ muỗng cà phê phân bón với một ga-lông (bằng 4,5 lít nƣớc) ngay tức khắc sau khi trồng phun vào cây. Đời sống cộng đồng của chúng kéo dài một năm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Water Richter (một nhà trồng lan nổi tiếng ngƣời Đức) trong cuốn “Orchideen, Pilezen, Vermehren, Zuchten” thì viết nhƣ sau: “Để trồng cây từ ống nghiệm ra ngƣời ta chuẩn bị chất nuôi cây gồm than bùn, than củi và cát với tỉ lệ ngang nhau, hạt khá nhỏ, độ ẩm bình thƣờng. Đồ đựng là các chậu đất hoặc đĩa, 1/3 phía dƣới ngƣời ta cho mảnh sành. Phía trên là các chất nuôi cây để khoảng cách từ 2-3 cm.
Ngƣời ta lấy cây con từ ống nghiệm ra một cách cẩn thận và cho vào bể nƣớc rửa sạch môi trƣờng dinh dƣỡng, nếu không nó dễ bị nhiễm khuẩn. Ngƣời ta trồng tƣơng đối chặt vào chậu và chú ý giữ gìn rễ hết sức cẩn thận. Khi trồng ấn nhẹ chất nuôi cây xuống”.
Một số cơ sở khoa học nƣớc ta đã nuôi cấy mô lan thành công trong ống nghiệm. Nhƣng việc đƣa cây con ra ngoài hàng loạt sau giai đoạn ống nghiệm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 39
chƣa thành công mỹ mãn. Cây con đƣa từ ống nghiệm ra, hoặc là chết hàng loạt, hoặc tỷ lệ sống chƣa cao, quy trình xử lý cho cây chƣa thật ổn định.
Giai đoạn ở trong chậu chung đối với từng loại lan là khác nhau và chế độ che sáng cũng khác nhau thƣờng tránh để ánh sáng trực tiếp chiếu vào cây. Đánh giá cây con khỏe mạnh và có thể chuyển sang giai đoạn chậu con thì phải đạt ở tiêu chuẩn sau đây:
Giả hành và lá phải xanh, cứng, không còn quá mọng nƣớc nhƣ khi mới lấy ở ống nghiệm ra.
Rễ còn nguyên vẹn, có màu trắng xanh, đầu rễ bắt đầu phát triển, nhú lên xanh đậm rất đẹp.
Khi trồng vào chậu con sống bình thƣờng nhƣ cây lớn (tất nhiên phải che nắng