Kiến nghị

Cần nghiên cứu với số lượng chủng vi khuẩn lao lớn hơn để có thể đánh giá chính xác hơn nữa tỷ lệ , vị trí, và tương quan kháng thuốc của các đột biến có thể xảy ra trên gen katG.

Khuyến cáo các cơ sở trong nước sử dụng sin h học phân tử để rút ngắn thời gian chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc .

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU:... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

1.1. Tình hình bệnh lao ... 3

1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới ... 3

1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam ... 5

1.1.3. Tình hình lao kháng thuốc ... 8

1.2. Vi khuẩn lao ... 10

1.2.1. Đặc điểm phân loại ... 10

1.2.2. Đặc điểm hình thể ... 10

1.2.3. Khả năng gây bệnh ... 10

1.2.4. Hệ gen của vi khuẩn lao ... 11

1.3. Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao ... 12

1.4. Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid ... 12

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG , VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U ... 14

2.1. Đối tượng nghiên cứu ... 14

2.2. Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ... 15

2.2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính ... 15

2.2.2. Các máy và thiết bị chính ... 16

2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu ... 16

2.3. Phương pháp nghiên cứu ... 17

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ... 17

2.3.2.1. Kỹ thuật nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu . 18 2.3.2.3. Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc trình tự tự động phân tích kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng ... 24

CHƢƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN ... 25

3.1. Kết quả nhân bản gen katG các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu ... 25

3.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E . coli DH5α ... 26

3.3. Kết quả tách dòng gen katG ... 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 42

1. Kết luận ... 42

1.1. Nhân bản thành công gen katG từ các chủng vi khuẩn lao ... 42

1.2. Đột biến trên gene katG liên quan đến tính kháng Isoniazid ở vi khuẩn lao ... 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Bộ Y tế , Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005.

2. Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị , Nhà xuất bản giáo dục .

3. Lê Thị Luyến , Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ , điều trị , dự phòng và nghiên cứu Lao tại Việt Nam , Hội thảo sinh học phân tử về bệnh lao , Đại học Quốc gia Hà Nội, tháng 8/2007.

4. Bộ Y tế, Viện Thông tin Thư viện Y học Trung ương (2007), Tình hình bệnh lao.

http://www.hoilhpn.org.vn/

5. Thuốc - sức khỏe (2009), Thuốc chống lao.

http://www.thuoc-suckhoe.com/khainiem/baiviet/phanloai062.htm

6. Phùng Công Thưởng (2007), Nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng rifampicin bằng phương pháp xác định đột biến trên gene rpoB , Luận văn thạc sỹ Y học.

7. Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của Mycrobacterium Tuberculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phổi , Luận án tiến sỹ Y học.

8. http://vi.wikipedia/wiki/cochedocluccuavikhuan

9. Lâm Kim Cương (2008), Ứng dụng phương pháp PCR để tìm vi trùng lao, http://www.yduocngaynay.com

11. Nguyễn Văn Cách (2005), Tin sinh học , Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.

12. PGS.TS. Bùi Khắc Hậu (2009), Tại sao vi khuẩn lao kháng thuốc.

http://www.toquoc.gov.vn/Print/Article/Tai-Sao-Vi-Khuan-Lao-Khang- thuoc/pdf

13. Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao, Luận án tiến sỹ Sinh học .

14. Trần Văn Sáng (1999), Sinh học phân tử và miễn dịch học trong bệnh lý hô hấp, Nhà xuất bản giáo dục .

15. Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học , Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật.

16. Nguyễn Xuân Triều (2006), "Chẩn đoán lao", Bài giảng lao và bệnh phổi sau đại học, Học viện quân y .

17. Phạm Thành Hổ (2006), Di truyền học, Nhà xuất bản giáo dục .

18. Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Đình Quyến , Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục .

19. Đoàn Trọng Phụng (2005), "Acid nucleic và sinh tổng hợp protein ", Hóa sinh y học, Học viện Quân Y, tr.191-270.

20. Phạm Hùng Vân (2007), Các quy trình kỹ thuật sinh học phân tử thường được sử dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu y sinh học.

http://www.nk-biotek.com.vn

21. Juan Carlos Palomino , Sylvia Cardoso Leão , Viviana Ritacco (2007), Tuberculosis 2007 - from basic science to patient care, http://www.tuberculosisTexbook.com.

22. WHO (2007), Fact sheet N0104 Revised March 2007, Tuberculosis,

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/.

23. Jame M. Musser (1995), Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic Insights, Clinical Microbiology Reviews, Vol. 8, No. 4, p.496-514.

24. Wu X, Zhang J, Hu Z (2009), Study on the mutations of ahpC genes in M. tuberculosis isoniazid-resistant isolates, 1998 Dec;21(12):727-9. Chinese.

25. WHO (2004), Anti - tuberculosis drug resistance in the world, Report No. 3, http://www.who.int/tb/publications/who_htm_tb_2004_343/en/.

26. WHO (2007), Global Tuberculosis Control Surveillance, Planning, Financing, WHO report 2007.

27. Sonal S.Munsiff et al (2002), Molecular Epidemology of Multidrug- Resistance Tuberculosis, New York city, Emerg Infect Dis 8(11) Centers for Disease Control and Prevention (CDC).

28. S.H.E. Kaufmann, H. Hahn, Mycrobacteria and TB.

29. Beate Heym, Ying Zhang, Sylvie Poulet (1993), Characterization of the katG Gene Encoding a Catalase-Peroxidase Required for the Isoniazid Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis.

30. Marttila HJ (2009), A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating from the St. Petersburg area in Russia, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9736581?ordinalpos=9&itool=EntrezS

ystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel. Pubmed_RVDocSum

31. Marttila HJ, Soini H, Huovinen P, Viljanen MK (2009), katG mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from

Finnish patients,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8878604?ordinalpos=11&itool=Entrez System2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPane l.Pubmed_RVDocSum

32. Aslan G, Tezcan S, Serin MS, Emekdas G (2009), Genotypic analysis of isoniazid and rifampin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Turkey,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18653964?ordinalpos=1&itool=Entrez System2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPane l.Pubmed_RVDocSum.

33. Amina A (2009), Genotypic detection of rifampicin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains by DNA sequencing: a randomized trial.

Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 8:4.

34. Ahmad S, Fares E, Araj GF, Chugh TD, Mustafa AS (2002), Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut. Inter J Tuber and lung dis 6(10):920-926.

35. Wengenack NL, Todorovic S, Yu L, Rusnak F (2009), Evidence for differential binding of isoniazid by Mycobacterium tuberculosis KatG and the isoniazid-resistant mutant KatG(S315T), Biochemistry. 1998 Nov 10;37(45):15825-34.

36. Tracevska T, Jansone I, Broka L, Marga O, Baumanis V (2009),

Mutations in the rpoB and katG genes leading to drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Latvia, J Clin Microbiol. 2002 Oct;40(10):3789-92.

37. Molecular Cloning (2007),

http://www.fermentas.com/catalog/cloning/index.html. 38. NCBI (2007), Mycobacterium tuberculosis H37Rv,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=83332. 39. NCBI (2007), NCBI/ BLAST Home, nucleotide blast,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi.

40. Neil W Schluger (2007), Epidemiology and molecular mechanisms of drug-resistant tuberculosis,

http://www.patients.uptodate.com/topic.asp?file=tubercul/9211.

41. V. Nikolayevsky, T.Brown, et al (2004), Detection of Mutations Associated with Isoniazid and Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from Samara Region, Russian Federation, J. Clin. Microbiol, 42(10), p.4498-4502.

42. Rakhi Agrawal (2006), DNA Isolation from Rhizobium by Phenol Chloroform Method,

http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/DNA-Isolation-from- Rhizobium-by-Phenol-Chloroform-Method-4449.html.

43. Sechi, L. A., S.Zanetti, et al (2001), Molecular basis of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium bovis strains isolated in Sardinia, Italy,

44. Miotto, P., Piana, et al., (2006). Use of Genotype MTBDR Assay for Molecular Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Clinical Strains Isoniazid in Italy.. J. Clin. Microbiol. 44: 2485- 2491.

45. Mateu Espasa et al (2005), Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 55, p. 860-865.

46. Sonal S. Munsiff et al (2002), Molecular Epidemology of multidrug- Resistant Tuberculosis, New York city, Emerg Infect Dis 8(11) Centers for Disease Control and Prevention (CDC).

47. Weezenbeck C.S.B, Veen J. (1995), Control of drug-resistant tuberculosis,

Tubercle and Lung Disease, 76: 455-459.

48. Escalante, P., S. Ramaswamy, et al (1998), Genotypic characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Peru, Tuber. Lung Dis. 79: 111-118.

49. Department of Biological Sciences 1000 Hilltop Circle Baltimore (2007),

Preparation of Genomic DNA from Bacteria,

http://www.research.umbc.edu/~jwolf/genomic.

50. Sambork and Russell (2001), Molecular cloning a laboratory manual

vol.1: 1.31-1.162, vol. 2: 8.18-8.113, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New york.

51. García de V, Infantes S D, Lasala F, Chaves F, Alcala L, Bouza E (2002),

mutations and high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol 40:988-995.

52. Dalla Costa and et (2009), Correlations of mutations in katG, oxyR-ahpC and inhA genes and in vitro susceptibility in Mycobacterium tuberculosis clinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent countries in South America.

53. Gonul Aslan and et (2008), Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern tukey.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

---

LÃ DUY ANH

XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID CỦA MỘT SỐ

CHỦNG VI KHUẨN LAO TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền Mã số: 60. 42. 70

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Chu Hoàng Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác.

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Chu Hoàng Hà – Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài này.

Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. TS. Lê Trần

Bình, TS. Nguyễn Hữu Cƣờng, TS. Nghiêm Ngọc Minh Viện Công nghệ

sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian làm việc tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.

Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà, CN. Nguyễn Văn Bắc và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Sinh KTNN - Đại học Sư phạm Thái Nguyên, khoa Sau Đại học - Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi học tập và hoàn thành nghiên cứu đề tài.

Cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, người thân, gia đình đã động viên giúp đỡ tôi rất nhiều.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, Tháng 9 năm 2009 Học viên

DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT INH RMP EMB PAS PAZ MDR EDR HRSE HRS DNA RNA PCR IPTG X-gal TAE LB dNTPs E.coli Taq-DNA polymeraza Bp Kb CNSH TTYTTT CTCLQG : Isoniazid : Rifampicin : Ethambutol : Paraminosalicylic acid : Pyrazinamid

: Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc)

: Exetensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng) : Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol.

: Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin : Acit deoxyribonucleic

: Acid Ribonucleic

: Polymerase Chain Reaction : Isopropyl-thio-β-D-galactoside : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside : Tris-Acetate-EDTA : Luria - Bertani : Deoxyribonucleotide Triphosphate : Escherichia coli

: Thermus aquaticus DNA polymerase

: Base pairs : Kilo base

: Công nghệ sinh học : Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ nghiên cứu 17

Sơ đồ qui trình nhân bản đoạn gen KatG 18

Sơ đồ qui trình tách dòng 20

Trang

Bảng 1.1: Ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực 4 Bảng 1.2: Bảng ước tính số bệnh nhân mắc lao mới qua mỗi năm ở

Việt Nam 7

Bảng 2.1: Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao 14

Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất ch ính 15

Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính 16

Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR 19 Bảng 2.5: Tính toán các thành phần cho phản ứng nối đầu A 21 Bảng 3.1: Các vị trí xảy ra đột biến trên đoạn gen katG của các chủng

vi khuẩn lao nghiên cứu 34

Bảng 3.2: Các vị trí xảy ra đột biến thay thế acid amin của các chủng

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 3.1: Điện di kiểm tra DNA các chủng vi khuẩn lao ĐA 1, ĐA2,

ĐA3, ĐA4, ĐA5, ĐA6, ĐA7, ĐA8, ĐA9, (-) 25

Ảnh 3.2: Điện di kiểm tra DNA các chủn g vi khuẩn lao ĐA10,

ĐA11, ĐA12, ĐA13, ĐA14 25

Ảnh 3.3: Ảnh 3.3: Sơ đồ vector pBT 27

Ảnh 3.4: Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trường

LB có bổ sung carbenicillin , X-gal và IPTG. 28 Ảnh 3.5: Điển di kiểm tra đoạn gen katG các mẫu ĐA1, ĐA3, ĐA6,

ĐA12, ĐA13 sau khi cắt bằng enzym BamHI. 29

Ảnh 3.6: Điện di kiểm tra đoạn gen katG các mẫu ĐA2, ĐA4,

ĐA5, ĐA8, ĐA11, ĐA 12 sau khi cắt bằng enzym BamHI. 29 Ảnh 3.7: Điện di kiểm tra đoạn ge n katG các mẫu ĐA7, ĐA9,

ĐA10 sau khi cắt bằng enzym BamHI. 30

Ảnh 3.8: Điện di kiểm tra đoạn gen katG các mẫu ĐA1, ĐA2,

ĐA5, ĐA14, S8 sau khi cắt bằng enzym BamHI. 30 Ảnh 3.9: So sánh trình tự nucleotide các mẫu bệnh phẩm vớ i trình tự

nucleotide của chủng dại H 37Rv 32

Ảnh 3.10: So sánh trình tự acid amin các mẫu bệnh phẩm với trình tự

PHỤ LỤC

 Các dung dịch sử dụng trong tách chiết plasmid từ vi khuẩn.:

- Sol I: Tris- HCL 25mM, pH=8; EDTA 10mM, pH=8; glucose 50mM.

- Sol II: NaOH 0,2M; SDS 1%.

- Sol III: kali axetat 3M; axit axetic 11,5%; natri axetat 3M.

 Dung dịch đệm TE: Tris-HCL 10mM, pH=8; EDTA 1mM, pH=8

 Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1), 24ml chloroform: 1ml isoamylalcohol

 Dung dịch đệm TAE đặc 50 lần: Tris-HCL 24,2%, axit axetic 5,71 ml, 10ml EDTA 0,5M pH=8

 Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide: 0,5μg/ml

 Các loại môi trường

- Môi trường LB lỏng: 0,5% dịch chiết nấm men; 1% bacto-pepton; 1% NaCl.

- Môi trường LB đặc: môi trường LB lỏng thêm 1,5% Bacto-aga

- Môi trường chứa chất cảm ứng IPTG: môi trường LB có bổ xung IPTG tới nồng độ cuối cùng 1mM