Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.col

Bước đầu tiên của quá trình tách dòng là thực hiện ph ản ứng gh ép nối gen katG và vector tách dòng pBT , đây là vector có nhiều ưu điểm như : kích thước nhỏ , có nhiều điểm cắt giới hạn của các enzym hạn chế . Đồng t hời, vector này còn chứa hai gen kháng kháng sinh ampicillin và ca rbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản hơn . Đặc biệt vector này rất thuận lợi cho

thao tác ghép nối các đoạn DNA ngoại lai do chúng được thiết kế dưới dạng mở vòng mạch thẳng với hai đầu 3' của mỗi sợi gắn thê m nucleotide T.

Ảnh 3.3: Sơ đồ vector pBT

Đầu 5' của đoạn gen katG có mang nucleotid e loại A . Vì vậy khi thực hiện phản ứng kết nối , gen katG sẽ dễ dàng được gắn vào vector theo nguyên tắc bổ sung . Phản ứng nối được xú c tác bởi T 4 DNA ligase . Bước tiếp theo chúng tôi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt . Sau đó, sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin , X- gal và IPTG . Sự có mặt của X -gal sẽ giúp cho việc chọn lọc các dòng tế bào

E. coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng. Kết quả được trình bày ở hình 3.2.

C ác v ị tr í c ắt củ a e nz ym g iớ i h ạn

Ảnh 3.4: Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trƣờng LB có bổ sung carbenicillin, X-gal và IPTG.

Trên môi trường có chứa kháng sinh carbenicillin, X-gal và IPTG , phát triển hai loại khuẩn lạc : khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng . Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã đượ c biến nạp plasmid chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin, nhưng chỉ có khuẩn lạc màu trắng mới mang plasmid tái tổ hợp . Vì những vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất ra β-galactosidase. Enzym này phân hủy cơ chất X-gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol , dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa tạo thành màu xanh . Nếu đoạn DN A ngoại lai xen vào giữ a gen lacZ thì gen này sẽ bị phá hỏng , enzym β-galactosidase không được tạo ra , vì thế mặc dù có X -gal trong môi trường nhưng cơ chất này không bị thủy phân , không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng .

3.3. Kết quả tách dòng gen katG

Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmi d tái tổ hợp chứa đoạn gen katG quan tâm, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật c olony- PCR. Vì số lượng khuẩn lạc sau khi biến nạp là rất nhiều nên chúng tôi chọn ngẫu nhiên 28 khuẩn lạc trắng để thực hiện phả n ứng colony -PCR sử dụng

cặp mồi katG F và katG R. Sản phẩm colony -PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Nếu khuẩn có plasmid mang gen

katG thì sản phẩm PCR sẽ xuất h iện một băng có kích thước mong muốn khoảng 684 bp. Đồng thời nuôi những khuẩn lạc này vào 3 ml LB lỏng có bổ sung carbenicillin, để tách plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự .

Sau khi nuôi khuẩn lạ c trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình của nhà sản xuất . Để khẳng định chắc chắn rằng plasmid mới tách chiết có mang đoạn gen katG quan tâm, chúng tô i tiến hành phản ứng cắt plasmid . Sản phẩm cắt plasmid được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện qua ảnh 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8.

Trên ảnh , các plasmid có mang gen katG có độ dài khoả ng 684 bp thì sẽ xuất hiện hai băng vạch . Một vạch có kích thước khoảng 684 bp, là kích thước của đoạn gen katG. Một vạch có kích thước khoảng 2,7 kb, là kích thước của vector pBT.

Thực hiện cắt plasmid bằng enzy m giới hạn BamHI xác định đoạn gen

katG trên 27 mẫu plasmid có 23 mẫu cho kết quả dương tính , 4 mẫu kết quả âm tính . Các kết quả âm tính này là do những sai sót trong lựa chọn mẫu để tách plasmid.

Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu plasmid cho thấy là các dòng tế bào được tăng sinh khá tốt và quá trình tinh sạch là đảm bảo chất lượng. Các tác giả khác khi sử dụng các bộ kit tinh sạch của các hãng như Fermentas, Promega... đều cho các kết quả tương tự.

Nồng độ vi khuẩn của các mẫu là tương đương và cùng được sử dụng một phương pháp tách chiết vì vậy n ồng độ của DNA plasmid các mẫu nghiên cứu khá đồng đều , chủ yếu từ 300-500 ng/µl.

Như vậy kế t quả tách chiết kiểm tra plasmid của chúng tôi đã khẳng định đoạn gen katG đã được nhân lên với số lượng lớn trong tế bào vi khuẩn

E.coli DH5α. Các mẫu DNA plasmid thu được có đủ điều kiện về độ tinh sạch và nồng độ phục vụ cho giải trình tự gen .

3.4. Kết quả phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cƣ́u.

Các chủng vi khuẩn lao sau khi đọc trình tự được xử lý kết quả qua phần mềm BioEdit . So sánh trình tự nucleo tide và acid amin từ các mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotid e và acid amin của chủng dại H 37Rv chúng tôi thu được kết quả đột biến trên các chủng lao kháng thuốc . Kết quả được thể hiện qua ảnh 3.9 và 3.10.

Ảnh 3.9: So sánh trình tƣ̣ nucleotide các mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotide của chủng dại H37Rv

Ảnh 3.10: So sánh trình tƣ̣ acid amin các mẫu bệnh phẩm với trình tự acid amin của chủng dại H37Rv

Bảng 3.1: Các vị trí xảy ra đột biến trên đoạn gen katG của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 612 628 673 708* 723* 742 761 768* 925 944 980 1060 1107* 1123 1129 1163 1203* 1205 1211 1 TGG- CGG GCC- GCT* AGC- ACC GGC- GGT* 2 AGC- ACC CCG- TCG 3 AGC- ACC ACC- GCC TTG- TCG 4 AAC- AAT* ATT- TTT AGC- ACC 5 AGC- ACC 6 ATG- GTG AAA- ATA 7 AGC- ACG ATG- GTG X 8 AGC- ACC 9 CCC- CCG* AGC- ACC GAG- GGG 10 11 CGC- CAC AGC- ACC 12 AGC- ACC CCC- CCA* 13 X GGT- TGT AGC- AAC 14 AGC- AAC

Chú thích: X: Vị trí đột biến mất mucleotide; *: Vị trí đột biến không dẫn đến sự thay đổi acid amin

Bảng 3.2: Các vị trí xảy ra đột biến thay thế acid amin của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu

204 210 225 248 254 309 315 327 354 356 375 377 388 402 404 1 W -> R S -> T 2 S -> T P -> S 3 S -> T T -> A L -> S 4 I -> F S -> T 5 S -> T 6 M -> V K -> I 7 S -> T M -> V X 8 S -> T 9 S -> T E -> G 10 11 R -> H S -> T 12 S -> T 13 X G -> C S -> N D -> G 14 S -> T Mẫu ĐB

Từ bảng thống kê 3.1 chúng tôi nhận thấy :

Đột biến xảy ra ở 13 mẫu trên tổng số 14 mẫu bệnh phẩm . Đột biến có thể xảy ra ở một điểm hoặc nhiều điểm trên đoạn gen katG quan tâm.

Mỗi acid amin có thể được mã hóa bở i nhiều bộ ba . Vì vậy k hông phải tất cả các đột biến đều dẫn đến sự hình thành một acid amin mới. Các đột biến làm xuất hiện bộ ba mã hóa mới , nhưng không dẫn đến sự hình thành acid amin mới thì không làm thay đổi cấu trúc bậc một của protein, do đó cấu trúc không gian của protein vẫn được giữ vững nên các đột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc . Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 1, tại điểm 768 có đột biến làm biến đổi bộ ba GCC thành GCT , tại điểm 1107 có đột biến làm biến đổi bộ ba GGC thành GGT; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 4, tại điểm 708 có đột biến làm biến đổi bộ ba AAC thành AAT ; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 9, tại điểm 723 có đột biến làm biến đổi bộ ba CCC thành CCG ; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 12, tại điểm 1203 có đột biến làm biến đổi bộ ba CCC thành CCA . Khi đối chiếu các điểm đột biến này sang bảng 3.4, chúng tôi nhận thấy các đột biến này không làm xuất hiện các acid amin mới . Từ đó chúng tôi kết luận các đột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid .

Từ bảng thống kê 3.2 chúng tôi nhận thấy :

Sự đột biến xảy ra ít nhất trên 1 codon và nhiều nhất là trên 3 codon như ở các mẫu bệnh phẩm ĐA 3, ĐA7, ĐA13.

Trong số 13 mẫu bệnh phẩm có mang đột biến thì có tới 11 mẫu có đột biến tại codon 315, chiếm 84,6%. Đột biến tại codon 315 này là đột biến thay thế 1 nucleotide loại G thành loại C , sự thay thế này làm bộ ba AGC trở thành ACC. Đột biến tại codon 315 cũng có thể là sự thay thế cùng lúc 2 nucleotide, như ở mẫu bệnh phẩm ĐA7. Sự thay đổi bộ ba mã hóa các acid amin kéo theo là sự thay đổi các acid amin do bộ ba đó quy định. Vì vậy acid amin tại codon 315 được biến đổi từ serine thành threonine . Năm 2009, Elis R Dalla Costa và

cộng sự đã tiến hành xác định các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc trên các gen katG, oxyR-ahpC và inhA . Với nghiên cứu ở gen katG, tác giả tiến hành thu thập 160 mẫu tại 3 nước thuộc Nam Mỹ có số bệnh nhân mắc lao kháng thuốc cao là Brazil , Peru và Argentina . Tại Brazil tác giả thu được 4 dạng đột biến , bao gồ m: S315T, S315N, S315I, G258D. Trong 4 dạng độ t biến thì đột biến S 315T chiếm tỷ lệ cao nhất , gần 94%. Tại Peru có 2 dạng đột biến là S 315T và S 315N, trong đó S 315T chiếm tỷ lệ lớn , gần 91%. Tại Argentina chỉ gặp dạng đột biến S 315T [52]. Năm 2008, Gonul Aslan và cộng sự đã tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm tại nhiề u vùng khác nhau tại C hâu Á để xác định các đột biến liên quan đến tí nh kháng thuốc trên các gen katG, inhA, rpoB. Tác giả đã tiến hành nghiên cứu 30 mẫu. Trong đó các mẫu được chẩn đoán c ó liên quan đến tính kháng i soniazid là 25 mẫu. Tiến hành đọc trình tự tác giả thu đư ợc 4 điểm đột biến trên gen katG. Tại codon 315 có các dạng đột biến : S315T, S315N, S315I, trong đó dạng đột biến S 315T chiếm tỷ lệ lớn, chiếm 72% [53]. Năm 2004, Marttila và cộng sự tiến hành thu thập 27 chủng lao kháng thuốc tại Nga . Sau khi tiến hành đọc trình tự , tác giả nhận thấy trong 27 mẫu bệnh phẩm có 24 mẫu là kháng i soniazid, trong đó 100% là đột biến S315T. Một chủng là đột biến trên gen rpoB, 2 chủng còn lại không kháng thuốc [30]. Năm 2008, Aslan và cộng sự đã tiến hà nh phân lập đồng thời 3 gen katG, inhA, rpoB để tiến hành nghiên cứu các đột biến c ó liên quan. Tại khu vực gen katG các tác giả đã phát hiện được đột biến ở các điểm 315, 279, 293. Trong đó đột biến S 315T là phổ biến nhất , chiếm tỷ lệ 60% [32]. Trong nghiên cứu của chúng tôi cũng gặp 2 dạng đột biến như của các tác giả là S 315T và S 315N, dạng đột biến S 315T cũng chiếm tỷ lệ rất cao , chiếm 84,6%. Dạng đột biến S 315I chúng tôi không gặp , có thể là do số lượng mẫu của chúng tôi còn hạn chế , hoặc đây có thể là dạng đột biến đặc trưng cho từng vùng địa lý . Như vậy, các mẫu lao kháng thuốc được thu thập

từ nhiều nơi trên thế giới có đặc điểm chung đó là xảy ra đột biến tại codon 315 với hai dạng đột bi ến điển hình là S 315T với một tần suất rất cao , bên cạnh đó là đột biến S 315N với tần suất nhỏ hơn . Như vậy , nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn thống nhất với các công bố trong và ngoài nước .

Đột biến tại vùng gen nghiên cứu không chỉ có đột biến thay thế

nucleotide mà còn có đột biến mất nucleotide . Đột biến mất nucleotide xảy ra ở 2 mẫu bệnh phẩm là ĐA 7 và ĐA 13. Đối với mẫu bệnh phẩm ĐA 7 có 3 điểm đột biến là thay thế nucleotide tại codon 315 và 377, mất nucleotide tại codon 388. Đột biế n tại codon 315 cũng là S 315T. Đối với mẫu bệnh phẩm ĐA13 có 3 điểm đột biến là mất nucelotide tại codon 210, thay thế nucleotide tại codon 309 và 315. Tuy nhiên khác với mẫu bệnh phẩm ĐA 7, tại mẫu bệnh phẩm ĐA 13 có đột biến m ất nucleotide tại condon 210, là codon nằm trước codon 315. Chính vì vậy khi mất nucleotide tại codon 210 sẽ làm lệch khung đọc tại codon 315. Như vậy tại codon 315 sẽ có cả đột biến thay thế nucleotide và cả đột biến do lệch kh ung đọc . Vì vậy đột biến tại codon 315 ở mẫu bệnh phẩm ĐA 13 làm biến đổi acid amine Serine thành Asparagine chứ không phải là Threonine như các mẫu bệnh phẩm khác .

Nghiên cứu của Elis R Dalla Costa và cộng sự [52] cũng chỉ ra r ằng, ngoài đột biến S 315T là đột biến phổ biến liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid thì vẫn tồn tại các đột biến khác như tại điểm 258 có đột biến G258D. Nghiên cứu của Gonul Aslan và cộng sự [53] khi nghiên cứu về xác định đột biến liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid cũng cho thấy , ngoài codon 315 là đột biến chính thì vẫn tồn tại các đột biến tại các codon khác, tác giả tìm thấy 2 đột biến khác đó là G 279T và A293T. Tuy nhiên , cả hai công bố trên không đưa ra được những chứng cứ về đột biến tại các điểm này có liên quan tới tính kháng thuốc . Trong nghiên cứu của chúng tôi , chúng tôi phát hiện ra một số điểm đột biến mới , các đột biến này chưa từn g được công bố trước đây. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 1, phát hiện đột biến tại codon 204, dạng

W204R. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 2, phát hiện đột biến tại codon 375, dạng P375S. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 3, phát hiện hai đột biến , tại codon 354 là T354A, tại codon 404 là L404S. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 4, phát hiện đột biến tại codon 248, dạng I248F. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 6, phát hiện hai đột biến , tại codon 225 là M 225V và tại codon 327 là K 327V. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 7, phát hiện độ t biến tại codon 377 là M 377V. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 9, phát hiện đột biến tại codon 402 là E402G. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 11, phát hiện đột biến tại codon 254, dạng R254H. Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 13, phát hiện hai đột biến, tại codon 309 là G309C, tại codon 356 là D356G. Với số lượng mẫu hạn chế và chưa có khả năng xét nghiệm protein nên chúng tôi chưa khẳng định được các đột biến này có liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid . Có thể đột biến này là các đột biến mới phát sinh không ảnh hưởng tới tính kháng thuốc , hoặc cũng có thể các đột biến này có liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid ở một mức đột nhất định . Để có thể đưa ra một kết luận chính xác về tính kháng thuốc của các mẫu bệnh phẩm này cần phải tiến hành trên 1 số lượng mẫu lớn hơn và các mẫu được thu thập ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới để nghiên cứu.

Mẫu bệnh phẩm ĐA 10 không thấy có sự đột biến trên codon nào củ a đoạn gen katG nghiên cứu , nhưng theo chẩn đoán kháng sinh đồ thì mẫu