2 Nội dung nghiên cứu
2.3Nghiên cứu phƣơng pháp sinh tổng hợp môi trƣờng rắn
2.3.1 Ảnh hƣởng của thời gian phản ứng
Cấy chủng F. oxysporumlên môi trƣờng rắn Malt-Yeast trong chai thủy tinh và ủ đến khi khuẩn lạc mọc kín bề mặt agar.Cho 20ml dung dịch AgNO3 (1mM) vào và sau thời gian mỗi 1 ngày tiến hành thu lấy dung dịch phản ứng.Ly tâm dịch phản ứng ở 3000rpm trong 10 phút, thu lấy phần dịch nổi, lọc qua màng 200nm để loại vi sinh vật. Quét phổ UV-Vis khảo sát sự tạo thành bạc nano theo thời gian phản ứng.
2.3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch AgNO3
Chuẩn bị các erlen chứa dung dịch với các nồng độ 2mM, 4mM, 6mM, 8mM, 10mM AgNO3 đã đƣợc hấp khử trùng.Cho 20ml dung dịch AgNO3 mỗi nồng độ vào mỗi chai thủy tinh chứamôi trƣờng rắn Malt-Yeast đã mọc kín bởi
F.oxysporum.Ủ các chai thủy tinh ở nhiệt độ phòng, trong tối 5 ngày.Ly tâm dịch
phản ứng ở 3000rpm trong 10 phút, thu lấy phần dịch nổi, lọc qua màng 200nm để loại vi sinh vật. Quét phổ UV-Vis khảo sát sự tạo thành bạc nano theo nồng độ AgNO3.
2.3.3
phƣ
: Cho 20ml dung dịch AgNO3 2mM vào
20x40cmchứa20ml môi trƣờng agar Malt-Yeast )
đã mọc kín bởi F.oxysporum. Ủ các chai thủy tinh ở nhiệt độ phòng, trong tối 5
ngày. Ly tâm dịch phản ứng ở 3000rpm trong 10 phút, thu lấy phần dịch nổi, lọc qua màng 200nm để loại vi sinh vật.
Dịch nổi này đƣợc trải lên lame để khô và đem phân tích XRD để khẳng định sự hiện diện của hạt nano bạc.
2.3.4 Khả năng ổn định của dung dịch bạc nano
Tiến hành tổng hợp dung dịch bạc nano trên môi trƣờng rắn Malt-Yest. Quét phổ UV-Vis dung dịch thu đƣợc (dung dịch D1). Lƣu mẫu sau 4 tháng, đem dung dịch đã lƣu (dung dịch D2) quét phổ UV-Vis lần nữa để kiểm tra độ ổn định của dung dịch bạc nano.
2.3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc nano
một phần bề mặt
.
Cấy chủng vi khuẩn (S.aureus hoặc E.coli) vào môi trƣờng Cao thịt_Peptone lỏng, nuôi cấy lắc 120rpm, trong 16 giờ hút dịch khuẩn để tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc nano sinh tổng hợp đƣợc.
Cho dịch vi khuẩn tác dụng với dung dịch bạc nano :
Bảng 2.1Các dung dịch bạc nano thử nghiệm kháng khuẩn với các hàm lượng bạc khác nhau Đơn vị tính: µl Dung dịch C1 C2 C3 C4 C0 Dung dịch bạc nano 1000 750 500 250 0 Nƣớc cất vô trùng 0 250 500 750 1000 Dịch vi khuẩn 1000 1000 1000 1000 1000 Pha loãng các mẫu theo dãy thập phân (10-1
, 10-2,…, 10-6), hút 500µl mỗi mẫu 1, 2, 3, 4 ở độ pha loãng 10-3
, 10-4; mẫu đối chứng ở độ pha loãng 10-5 , 10-6 3 đĩa petri. Môi trƣờng agar sau khi hấp khử trùng đƣợc làm mát trong bể ổn nhiệt ở 45oC.
Đổ vào mỗi đĩa đã cấy 10 - 15ml môi trƣờng agar (45oC), lắc đĩa theo chiều kim đồng hồ và ngƣợc chiều kim đồng hồ khoảng 5-6 lần, đặt đĩa trên mặt phẳng ngang và đợi cho đĩa đông đặc.
Lật ngƣợc đĩa, và ủ trong 2 ngày đếm số khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi đĩa và tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu. Số lƣợng khuẩn lạc tối ƣu ở mỗi đĩa đƣợc đề nghị bởi các cơ quan có uy tín nhƣ FDA, AOAC là 25-300 khuẩn lạc/đĩa.
Công thức tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu từ số liệu của độ pha loãng:
Mi (CFU/ml) = (Ai x Di)/V
Trong đó: Ai: là số khuẩn lạc trung bình trên đĩa Di: là độ pha loãng
V: là dung tích huyền phù tế bào cho mỗi đĩa (ml)
Hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu dung dịch bạc nano đƣợc đánh giá dựa vào sự giảm số lƣợng vi khuẩn tính theo phần trăm hay hiệu suất kháng khuẩn theo công thức sau:
H = (N1 – N2)/N1 x 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó: N1: là số khuẩn lạc trong đĩa đối chứng
N2: là số khuẩn lạc trong đĩa chứa chất kháng khuẩn
2.4 Mô hình máng nghiêng sinh tổng hợp bạc nano
Hình 2.1Mô hình hoạt động của hệ thống máng nghiêng
Việc xây dựng hệ thống sinh tổng hợp máng nghiêng nhằm tiết kiệm thời gian và công sức so với nuôi cấy lỏng và hạn chế tình trạng ức chế ngƣợc trong quá trình ủ vi sinh với dung dịch Ag+
Dựa vào tác dụng của trọng lực, dòng Ag+ sẽ chuyển động từ từ theo máng nghiêng, đi qua và tiếp xúc với lớp F. oxysporum phủ kín trên bề mặt agar, nhờ đó sẽ diễn ra quá trình chuyển hóa Ag+ về Bạc nano.
Máng nghiêng có thể điều chỉnh độ dốc để thời gian lƣu của dòng Ag+ có thể thay đổi.
2.4.1 Cấu tạo và hoạt động
Hệ thống đƣợc cấu tạo từ 8 máng bằng mica ghép lại, mỗi máng có kích thƣớc 20×30 cm và gờ cao 1 cm để giữ agar. Các máng này đƣợc gắn trong hộp khung chứa chữ nhật cũng bằng mica có kích thƣớc 40x40x80 cm. Hộp này có cửa để thao tác thí nghiệm và vệ sinh máng.
Các máng đƣợc xếp song song ngƣợc chiều và cách nhau 7cm. Một đầu của mỗi máng đƣợc cố định vào vách của hộp khung nhờ vào các đai ốc, đầu còn lại đƣợc nâng đỡ nhờ vào các thanh điều khiển độ dốc.Có thể thay đổi đồng loạt độ nghiêng của các máng bằng cách điều khiển các thanh này để cho AgNO3 chảy xuống với tốc độ khác nhau.
Dung dịch AgNO3đƣợc bơm phun lên máng đầu tiên của hệ thống. Khi dung
dịch AgNO3 sẽ chảy sang máng tiếp theo. Qu
. Dùng dung dịch thu đƣợc cho qua máng lần nữa để tăng thời gian lƣu.
2.4.2
Khảo sát quá trình sinh tổng hợp bạc nano bằng cách thay đổi thời gian lƣu với dung dịch bạc nitrat AgNO3 2mM ứng với các giá trị thời gian lƣu12h, 24h, 36h, 48h, 72h. Mẫu bạc nano thu đƣợc theo thời gian đƣợc đemquét phổ UV-Vis.
Tiến - 121oC trong 15 phút.
Sau khi chờ môi trƣờng nguội ta có thể đổ môi trƣờng agar Malt-Yeast .
Hút 3ml F. oxysporum cho vào mỗi máng và trải đều. Ủ nhiệt độ phòng chờ nấm mọc kín mặt agar trong khoảng 2ngày.
Tiến hành lắp các máng vào hệ thống, cho dung dịchAgNO3chảy vào máng.
Chƣơng 3
3 Kết quả - Thảo luận
3.1 Quan sát hình thái F. oxysporum
Hình thái sợi nấm trên môi trƣờng thạch
Sau 2 ngày ủ chủng F. oxysporum trên môi trƣờng rắn Malt-Yest, ta tiến
hành quan sát hình thái sợi nấm.
A B
Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc F. oxysporum nuôi trên môi trường rắn Malt-Yeast (A) và hình từ Internet (B) [31]
Hình thái sợi nấmF. oxysporum đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng rắn Malt- Yeast có màu trắng phớt hồng, khuẩn lạc xốp, mọc lan kín mặt thạch của môi trƣờng.
Hình thái sợi nấm, bào tử trên kính hiển vi
Hình 3.2 Hình thái F. oxysporum dưới kính hiển vi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nấm F. oxysporum có sợi đa bào phân nhiều nhánh xếp thành tầng, sinh sản vô tính tạo ra hai loại bào tử:
- Bào tử lớn hình lƣỡi liềm (hình thái đặc trƣng của F. oxysporum) một đầu
thon nhọn, một đầu thon gãy khúc, và có các ngăn ngang. - Bào tử nhỏ hình cầu, hình hình bầu dục dài hay hình quả thận
Sợi đa bào của nấm F.oxysporum Bào tử lớn hình lƣỡi liềm Bào tử nhỏ hình cầu
3.2 Các phƣơng pháp sinh tổng hợp bạc nano khác nhau
Mẫu 1 Mẫu 2
Mẫu 3 Mẫu 4
Hình 3.3Dung dịch AgNO3các phương pháp sinh tổng hợp bạc nano khác nhau
Sau khoảng 5 đến 7 ngày tiếp xúc với F. oxysporum (sinh khối hay nƣớc lọc sinh khối), dung dịch AgNO3 trong các môi trƣờng phản ứng sinh tổng hợp bạc
nano 1 –
2, 3, 4), cho thấy có sự khử ion Ag+ Ag0 tạo bạc nano. Kết quả thu nhận đƣợc trình bày trong hình 3.3.
Tiến hành quét phổ UV-Vis của các mẫu trên để xác định chính xác sự hiện diện của bạc nano trong các mẫu.
Đồ thị 3.1 Phổ UV-Vis của dung dịch bạc nano với các phương pháp sinh tổng hợp khác nhau
Bảng 3.1 Bảng đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch bạc nano được sinh tổng hợp trên môi trường Malt-Yeast với các phương pháp khác nhau
Mẫu Phƣơng pháp Đỉnh hấp thu (nm) Cƣờng độ hấp thu
1 Đối chứng 0 0
2 AgNO3 – nƣớc lọc sinh khối 375 1,43
3 AgNO3 –sinh khối 376 1,66
4 AgNO3 – sinh khối trên mặt agar
377 2,30
423 1,75
Dựa vào Đồ thị 3.1và Bảng 3.1cho thấy cả 3 mẫu đều có đỉnh nhô cao trong vùng 380nm, mẫu 2 (đỉnh 375nm), mẫu 3 (đỉnh 376nm), mẫu 4 (đỉnh 377nm), cho
0 1 2 3 350 450 550 650 750 Wavelength (nm) A b s Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 3 77nm 4 23nm
thấy có sự hiện diện của bạc nano. Ngoài ra, ở mẫu 4 ta còn thấy có thêm một đỉnh nhô cao ở 423nm, cũng là đỉnh hấp thu của bạc nano. Và độ hấp thu của các đỉnh nhô cao ở mẫu 4 lớn hơn đáng kể so với mẫu 2 và mẫu 3, điều này chứng tỏ lƣợng bạc nano đƣợc tạo ra trong mẫu 4 là nhiều nhất.
Mặt khác, phƣơng pháp sinh tổng hợp dung dịch bạc nano ở mẫu 2, mẫu 3 (nuôi cấy chủng F. oxysporum trên môi trƣờng Malt-Yeast
), và còn phải tiến hành nhiều bƣớc ly tâm, lọc để thu sinh khối, rửa sinh khối, loại bỏ bã sinh khối,… để thu lấy dung dịch tạo thành. Trong khi phƣơng pháp tổng hợp dung dịch bạc nano ở mẫu 4 (nuôi cấy chủng F. oxysporum trên môi trƣờng rắn Malt-Yeast
), và chỉ tiến hành 1 bƣớc ly tâm, lọc để loại bỏ bã sinh khối thu lấy dung dịch tạo thành.
, sử dụng môi trƣờng rắn Malt-Yeastđể nuôi cấy F. oxysporum và
tiến hành sinh tổng hợp bạc nano trong cùng không gian, khác về thời gian (nuôi cấy cho F. oxysporum mọc kín rồi bổ sung dung dịch AgNO3
3.3 Nghiên cứu phƣơng pháp sinh tổng hợp môi trƣờng rắn 3.3.1 Ảnh hƣởng của thời gian phản ứng 3.3.1 Ảnh hƣởng của thời gian phản ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đồ thị3.2 Phổ UV-Vis của dung dịch thu được theo thời gian phản ứng
Đồ thị3.2cho thấy chỉ có 2 phổ có đỉnh hấp thu nhô cao ở vùng 380nm chứng tỏ có sự hiện diện của bạc nano. Đó là phổ của dung dịch sau thời gian 5 ngày (đỉnh hấp thu 377nm, cƣờng độ hấp thu là 2,37) và 6 ngày (đỉnh hấp thu 380nm, cƣờng độ hấp thu 2,71 ).
Ngoài ra, còn thấy có các đỉnh khác nhô cao ở vùng khoảng từ 260nm đến 300nm, đƣợc xác định có sự hiện diện của các thành phần trong protein doF.oxysporumsinh ra, có tác dụng ổn định, tránh hiện tƣợng kết tụ của các hạt bạc nano ngay trong môi trƣờng sinh tổng hợp theo Ahmad và cộng sự [5].
, dung dịch AgNO3 phản ứng trong môi trƣờng nuôi cấy F. oxysporum sau 5 ngày trở lên mới sinh tổng hợp đƣợc dung dịch bạc nano, điều này
có thể do chủng cần thời gian để thích nghi với môi trƣờng nồng độ Ag+ cao [5].
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 250 350 450 550 650 750 Wavelength (nm) A bs 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 3 77nm 3 80nm
3.3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch AgNO3
Đồ thị3.3 Phổ UV-Vis của dung dịch bạc nano với các nồng độ AgNO3 khác nhau
Bảng 3.2 Bảng đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch bạc nano được sinh tổng hợp với các nồng độ dung dịch AgNO3 khác nhau
Nồng độ AgNO3 Đỉnh hấp thu (nm) Cƣờng độ hấp thu
2 mM 374 1,51 4 mM 375 1,68 6 mM 376 2,02 8 mM 378 2,67 10 mM 378 2,70 0 1 2 3 4 5 250 350 450 550 650 750 Wavelength (nm) A bs 2mM 4mM 6mM 8mM 10mM
Đồ thị3.3và Bảng 3.2cho thấy tất cả các phổ đều có đỉnh nhô cao ở vùng 380 nm, đƣợc xác định là có sự hiện diện của bạc nano. Các đỉnh nhô cao ở các nồng độ AgNO3 khác nhau lần lƣợt là: 2 mM (đỉnh 374 nm), 4 mM (đỉnh 375 nm), 6 mM (đỉnh 376 nm), 8 mM (đỉnh 378 nm), 10 mM (đỉnh 378 nm). Cƣờng độ hấp thu của các đỉnh này tăng dần theo sự gia tăng nồng độ của dung dịch AgNO3.
Các đỉnh khác nhô cao ở vùng từ 260 nm đến 300 nm, đƣợc xác nhận là sự hiện diện của các thành phần protein do chủng F. oxysporum sinh ra, có tác dụng ổn định, tránh hiện tƣợng kết tụ của các hạt bạc nano ngay trong môi trƣờng sinh tổng hợp.
Nhƣ , khi nồng độ AgNO3 càng tăng thì độ hấp thu của các đỉnh này càng lớn cho thấy lƣợng bạc nano sinh ra càng nhiều, tuy nhiên ở các nồng độ AgNO3 thấp thì các đỉnh hấp thu nhọn hơn, điều này có khả năng là các hạt bạc nano sinh ra ở nồng độ thấp có kích thức nhỏ hơn.
Ngoài ra, từ đồ phổ UV-Vis ta còn thấy 2 phổ của dung dịch AgNO3
tăng nồng độ AgNO3 ) thì lƣợng bạc nano cũng tăng
không đáng . 0 5 10 15 20 25 30 35 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 đƣờng kính (nm) tầ n s ố ( % ) AgNO3 2 mM dtb: 6,6 0,3nm
Hình 3.4Ảnh TEM của hạt bạc nano được sinh tổng hợp vớiAgNO3 8mM và đồ thị sự phân bố hạt bạc nano
Ảnh chụp TEM của hạt bạc nanoHình 3.4đã chứng minh những nhận xét ban đầu là chính xác, với nồng độ AgNO3 càng cao thì lƣợng bạc nano sinh ra càng nhiều, nhƣng kích thƣớc hạt trung bình lớn và độ phân bố kích thƣớc hạt rộng. Với nồng độ AgNO3 8mM thì kích thƣớc hạt trung bình là 10,4nm và độ phân bố kích thƣớc hạt là 3 – 20nm, còn với nồng độ AgNO3 2mM thì kích thƣớc hạt trung bình là 6,6 nm và độ phân bố kích thƣớc hạt là 5 – 28nm.
3.3.3
3.5 -ray của bạc nano tổng hợp bởi
0 5 10 15 20 25 30 35 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 đƣờng kính (nm) tầ n s ố ( % ) AgNO3 8 mM dtb: 10,4 1,0nm
3.5 thể hiện giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu bạc nano tổng hợp bởi F. oxysporum. Trên hình có 4 đỉnh ở những vị trí 2θ vào khoảng 38, 44, 64 và 78°. Đây chính là các đỉnh đặc trƣng cho các mặt (1 1 1), (2 0 0), (2 2 0) và (3 1 1) của mạng lập phƣơng tâm mặt (FCC) của kim loại Ag.Với những đỉnh nhƣ trên ta có thể khẳng định sự tồn tại của Ag kim loại trong mẫu.
3.3.4 Khả năng ổn định của dung dịch bạc nano
Quét phổ UV-Vis cùng một mẫu dung dịch bạc nano: mới tạo thành và sau thời gian 4 tháng.
Đồ thị3.4 Phổ UV-Vis để kiểm tra khả năng ổn định của dung dịch bạc nano
Trong đó: Dung dịch D1: mẫu bạc nano mới tạo thành Dung dịch D2: mẫu bạc nano sau 4 tháng
Đồ thị3.4cho thấy 2 phổ dung dịch bạc nano lúc mới tạo thành và sau thời gian 4 tháng đều có đỉnh nhô cao ở khoảng 375nm đƣợc xác nhận là có sự hiện diện của bạc nano, và 2 phổ gần nhƣ giống nhau, chứng tỏ rằng dung dịch bạc nano có khả năng ổn định tốt ngay cả trong môi trƣờng nƣớc nhờ các polymer sinh học (chính là các protein của vi sinh vật) giúp ổn định, tránh hiện tƣợng kết tụ của các hạt bạc nano[5].
, dung dịch bạc nano đƣợc sinh tổng hợp với chủng F. oxysoprum . Đây chính là một trong những ƣu điểm của phƣơng pháp sinh học.
3.3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc nano (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trong chai sau 5 ngày 35,2 ppm.
Dung dịch bạc nano này đƣợc pha loãng với nƣớc cất vô trùng theo tỉ lệ khác nhau tạo thành các dung dịch bạc nano khác nhau (C1, C2, C3, C4) để tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn với chủng S.aureusvà E. coli (ủ trong 30 phút).
Bảng 3.3 Hiệu suất kháng khuẩn của các dung dịch bạc nano
Dung dịch Hàm lƣợng Ag (ppm) S.aureus E.coli Mtb (CFU/ml) H (%) Mtb (CFU/ml) H (%) C1 35,2 1,88±0,41.105 94,35 9,94±0.28.102 99,98 C2 26,4 2,22±0,49.105 93,35 7,36±0,17.104 98,52 C3 17,6 3,89±0,19.105 88,32 1,26±0,15.105 97,46 C4 8,8 6,80±0,46.105 79,60 7,29±0,29.105 85,34 C0 0 3,33±0,52.106 0 4,97±0,26.106 0 Mtb (CFU/ml)
Đồ thị3.5 Đồ thị biểu diễn hiệu suất kháng khuẩn theo hàm lượng Ag
Bảng 3.3vàĐồ thị3.5, cho thấy khả năng kháng khuẩn của dung dịch bạc nano tăng theo hàm lƣợng bạc trong dung dịch, khả năng kháng vi khuẩn Gram âm (E.coli) thể hiện rõ hơn so với Gram dƣơng (S.aureus) do vách Gram âm mỏng hơn. Hiệu suất kháng khuẩn thấp nhất là 85,34% (E.coli) và 79,60% (S.aureus) ở nồng độ Ag 8,8ppm và cao nhất là 99,98% (E.coli) và 94,35% (S.aureus) ở nồng độ Ag 35,2ppm. Theo tiêu chuẩn State Standard GB1598-1995 của Bộ Sức khoẻ Trung Quốc về v
, dung dịch bạc nano đƣợc tạo bằng phƣơng pháp sinh học có k 90% d 20ppm. 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 H iệ u