1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
2.5. Khảo sát phản ứng transeste hóa xúc tác lipase
2.5.1. Các bước tiến hành thí nghiệm:
Bƣớc 1: Cân chính xác 10g dầu cho vào erlen 250ml, rồi cho một lƣợng metanol cần thiết vào. Đặt erlen lên bếp khuấy từ để khuấy đều hỗn hợp khoảng 5 phút. Chú ý phải đậy kín để tránh metanol bay hơi.
Bƣớc 2: Cho tiếp vào erlen một lƣợng enzym thích hợp rồi đem gắn hỗn hợp phản ứng vào hệ thống đun hoàn lƣu, gia nhiệt và khấy từ trong một khoảng thời gian thích hợp.
Bƣớc 3: Sau khi thực hiện phản ứng xong, để nguội hỗn hợp rồi cho vào bình lóng để yên khoảng 15 phút. Sau đó tiến hành chiết ta thu đƣợc metyl este thô. Tiến hành rửa sản phẩm nhiều lần với nƣớc và làm khô sản phẩm bằng silicagen để thu đƣợc metyl este tinh khiết.
Bƣớc 4: Đánh giá độ tinh khiết của metyl este thu đƣợc bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng với pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254 có kích thƣớc hạt từ 10 – 40m, Sbm = 200 – 400m2/g, với pha động là hệ giải ly ete dầu hỏa:triclometan = 3:1. Chất hiện màu là hơi iốt.
Hiệu suất chuyển hóa của phản ứng đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: H (%): Hiệu suất chuyển hóa
mTT: khối lƣợng metyl este cân theo thực tế mLT: khối lƣợng metyl este tính theo lý thuyết Tính toán lƣợng metanol cần dùng cho mỗi thí nghiệm
Thí nghiệm: mdầu = 10g Mdầu = 848g Mmetanol = 32,04g Khối lƣợng metanol cần dùng cho mỗi thí nghiệm:
mmetanol = nmetanol x 32,04 = tỉ lệ x 10
2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa của phản ứng điều chế metyl este
2.5.2.1. Ảnh hưởng của lượng enzym xúc tác
Thực hiện thí nghiệm với 10g dầu ăn đã qua sử dụng và cố định các yếu tố nhƣ: nhiệt độ, thời gian phản ứng, tốc độ khuấy, tỉ lệ mol metanol/dầu.
Các yếu tố cố định
Thay đổi tỉ lệ % (v/w) enzym và dầu ăn đã qua sử dụng nhƣ sau: 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%.
2.5.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ mol metanol/dầu
Thực hiện thí nghiệm với 10g dầu ăn đã qua sử dụng và cố định các yếu tố nhƣ: nhiệt độ, thời gian phản ứng, tốc độ khuấy, tỉ lệ % (v/w) của xúc tác enzym/dầu.
Các yếu tố cố định
Yếu tố cố định Giá trị
Dầu ăn đã qua sử dụng 10 gam
Nhiệt độ 55C
Thời gian phản ứng 24 giờ
Tốc độ khuấy 200 – 300 vòng/phút
Tỉ lệ % (v/w) của xúc tác enzym/dầu Đƣợc chọn từ thí nghiệm 2.5.2.1
Thay đổi lƣợng metanol (ml) theo các tỉ lệ mol metanol/dầu nhƣ sau: 3:1, 6:1, 8:1, 10:1.
2.5.2.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Thực hiện thí nghiệm với 10g dầu ăn đã qua sử dụng và cố định các yếu tố nhƣ: nhiệt độ, tốc độ khuấy, tỉ lệ mol metanol/dầu, tỉ lệ % (v/w) của xúc tác enzym/dầu.
Yếu tố cố định Giá trị Dầu ăn đã qua sử dụng 10 gam
Nhiệt độ 55C
Thời gian phản ứng 24 giờ
Tốc độ khuấy 200 – 300 vòng/phút Tỉ lệ mol metanol/dầu. 6:1
Các yếu tố cố định
Yếu tố cố định Giá trị
Dầu ăn đã qua sử dụng 10 gam
Nhiệt độ 550C
Tỉ lệ % (v/w) của xúc tác enzym/dầu 14%
Tốc độ khuấy 200 – 300 vòng/phút
Tỉ lệ mol metanol/dầu. Đƣợc chọn từ thí nghiệm 2.5.2.2
Thay đổi thời gian phản ứng (giờ) với những giá trị nhƣ sau: 24 giờ, 28 giờ, 32 giờ, 36 giờ.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kiểm tra chất lƣợng và xác định thành phần nguyên liệu
3.1.1. Xác định độ ẩm và chỉ số của dầu ăn đã qua sử dụng.
Bảng 3.1: Độ ẩm và chỉ số axit của dầu.
Chỉ tiêu Dầu
Độ ẩm (%) Chỉ số axit (Ca) Dầu ăn đã qua sử dụng 0,16 0,89
Dầu ăn chợ - 0,43
Dựa vào kết quả bảng 3.1 ta thấy độ ẩm của dầu ăn qua sử dụng khá thấp nên gần nhƣ không ảnh hƣởng đến các tiến trình thí nghiệm. Chỉ số axit của dầu ăn đã qua sử dụng cao hơn dầu ăn ở chợ bán theo kilogam. Điều này chứng tỏ dầu ăn đã qua sử dụng có hàm lƣợng axit béo tự do cao hơn dầu ăn chƣa sử dụng. Tuy nhiên, mẫu dầu nghiên cứu có chỉ số axit nhỏ hơn 5 nên trong quá trình thí nghiệm không cần hạ chỉ số axit của dầu ăn đã qua sử dụng khi điều chế metyl este.
3.1.2. Phân tích thành phần axit béo của dầu ăn đã qua sử dụng
Phân tích mẫu dầu ăn đã qua sử dụng bằng phƣơng pháp GC/FID cho kết quả nhƣ bảng 3.2.
Bảng 3.2: Thành phần phần trăm của các axit béo trong nguyên liệu dầu ăn đã qua sử dụng
Thành phần axit béo Thành phần phần trăm (%)
Octanoic axit (C12:0) 0,17 Tetradecanoic axit (C14:0) 0,91 Hexadecanoic axit (C16:0) 31,74 Cis-Hexadecanoic axit (C16:1) 2,35 Octadecanoic axit (C18:0) 4,01 Cis-9-Octadecanoic axit (C18:1) 44,87 Cis-9-12-Octadecanoic axit (C18:2) 13,98 Ecosanoic axit (C20:0) 0,26 Octadecatrienoic axit (C18:3) 0,37 Cis-11-Ecosenoic axit (C20:1) 0,17 Eicosatetraenoic axit (C20:4) 0,12 Dosahexaenoic axit (C22:6) 0,67
Dựa vào kết quả phân tích của bảng 3.2 Ta tính đƣợc khối lƣợng phân tử trung bình của dầu ăn đã qua sử dụng là 848 (g/mol).
Kết quả bảng 3.2 cho thấy dầu ăn đã qua sử dụng nhiều lần hầu nhƣ thành phần axit béo không no nhiều nối đôi có tỉ lệ rất thấp (nhỏ hơn 0,5%), chủ yếu là axit palmitic (31,74%) và oleic (44,87%). Dựa vào tỉ lệ phần trăm của mỗi loại axit béo trong bảng kết quả xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử trung bình của mẫu dầu ăn sử dụng trong đề tài là 848 gam/mol. Số liệu này cũng đƣợc sử dụng để tính hiệu suất chuyển hóa của phản ứng điều chế metyl este.
3.1.3. Xác định hàm lượng protein của Lipozyme TL 100L
Để xác định hàm lƣợng protein trong dịch enzym thí nghiệm, đầu tiên tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn BSA với protein chuẩn là albumin huyết thanh bò. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.3. Từ sự tƣơng quan giữa nồng độ albumin và giá trị OD595 xây dựng đƣờng chuẩn albumin hình 3.1.
Đƣờng chuẩn có hệ số gốc là 0,0026 và độ tin cậy R2
là 0,9936. Căn cứ vào đƣờng chuẩn vừa xây dựng tính hàm lƣợng protein đƣợc suy ra từ công thức:
y = 0,0026x + 0,0179
Để kết quả có độ chính xác cao, dung dịch enzym mẫu đƣợc pha loãng sao cho giá trị OD595 nằm trong đƣờng chuẩn.
Lipozyme TL 100L là enzym thủy phân lipase thƣơng mại của hãng Novozymes, Đan mạch đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp đƣợc chiết xuất từ chủng
Thermomyces lanuginosus. Kết quả bảng 3.3 nhận thấy hàm lƣợng protein trong
Lipozyme TL 100L khá cao. Vì vậy trong tiến trình phản ứng cần chú ý đến các yếu tố làm ảnh hƣởng đến hoạt tính enzym. Kết quả này làm cở sở để tính toán hoạt tính đặc hiệu enzym trong đề tài cũng nhƣ các nghiên cứu tiếp theo về cố định enzym.
Bảng 3.3: Hàm lƣợng protein của Lipozyme TL 100L
Mẫu OD595 Nồng độ BSA (µg/ml) Hàm lƣợng protein trung bình (mg/ml) 1 0,367 134,269 13,068 2 0,358 130,807 3 0,348 126,962 Hình 3.1: Đƣờng chuẩn Albumin
3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính lipase
3.2.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase
Lipase nói riêng và enzym nói chung rất nhạy đối với pH môi trƣờng. pH thay đổi sẽ ảnh hƣởng đến trạng thái ion của enzym. Mỗi loại enzym tùy thuộc vào nguồn gốc sản sinh ra đều có trị số pH tối ƣu cho nó hoạt động. Vì vậy việc khảo sát ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzym Lipozyme TL 100L đƣợc thực hiện ở các giá trị pH khác nhau. Kết quả đƣợc ghi nhận trong hình 3.2 và bảng 2 (phần phụ lục)
Qua hình 3.2 cho thấy hoạt tính của lipozyme TL100L đạt tối ƣu tại pH bằng 8. Khi tăng pH lên 8,5 và 9,0 hoạt tính của enzym giảm mạnh. Lipozyme TL100L hoạt động thích hợp trong khoảng pH từ 7,0 đến 8,0. Ở khoảng pH này rất thuận lợi cho việc thực hiện các phản ứng transeste hóa vì các sản phẩm sinh ra từ phản ứng này sẽ không ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính enzym.
Kết quả trên cũng tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của tác giả Adriano. A và cộng sự [1]
khi sử dụng lipase từ chủng Thermomyces lanuginosus để cố định enzym có pH hoạt động thích hợp 7-8 trên cơ chất dầu olive hoặc nghiên cứu của Brenda .R và cộng sự [4]
sử dụng enzym lipase từ Thermomyces lanuginosus đƣợc cố định trên PVA-alginate có pH hoạt động bằng 7 trên cơ chất p-nitrophenol palmitic.
Vậy từ kết quả trên chọn pH bằng 8 để tiến hành khảo sát các yếu tố khác trong đề tài.
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase
Nhiệt độ là một thông số quan trọng ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng và hoạt
thì vận tốc đạt cực đại nhƣng nếu tiếp tục tăng thì vận tốc enzym sẽ giảm vì nhiệt độ cao sẽ làm biến tính protein gây bất hoạt enzym. Tiến hành khảo sát hoạt tính của lipase ở các nhiệt độ khác nhau từ 350C đến 700C để tìm khoảng nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của lipozyme TL100L. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.3 và bảng 3 (phần phụ lục)
Kết quả trong hình 3.3cho thấy ở nhiệt độ 350C hoạt tính của lipozyme TL100L rất thấp đạt 3409,12 U/mg protein. Hoạt tính tăng dần và đạt cực đại tại nhiệt độ 650
C 8228,18 U/mg protein. Khi nhiệt độ tăng cao hơn 70-75oC, hoạt tính lipase bắt đầu giảm dần.
Theo nghiên cứu của Adriano. A và cộng sự [1]
nhiệt độ tối ƣu khi sử dụng lipase chƣa cố định từ chủng Thermomyces lanuginosus là 60oC nhƣng khi đƣợc cố định trên chitosan-alginate-TNBS-glutaraldehyde sẽ chịu đƣợc nhiệt cao hơn và đạt tối ƣu ở 65oC. So sánh với kết quả này lipozyme TL100L có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ cao hơn . Điều này khá thuận lợi cho việc thực hiện phản ứng transeste hóa khi thực hiện đƣợc ở nhiệt độ cao mà không làm ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính enzym.
Từ kết quả trên chọn nhiệt độ tối ƣu cho enzym hoạt động là 650C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt của lipase
Enzym có bản chất là protein, vì thế ngoài việc khảo sát nhiệt độ tối ƣu để enzym đạt hoạt tính cao nhất thì yếu tố độ bền nhiệt cũng không kém phần quan trọng. Đặc biệt khi thực hiện xúc tác phản ứng transeste hóa điều chế metyl este thƣờng cần kéo dài thời gian phản ứng để đạt Hiệu suất chuyển hóa cao. Vì vậy, để khảo sát đặc điểm
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase
này dịch enzym đƣợc ủ ở các nhiệt độ 50, 55, 60, 65oC. Sau các thời điểm 3giờ, 5giờ, 7giờ và 24 giờ lấy enzym đo hoạt tính. Kết quả độ bền nhiệt độ theo thời gian của lipase đƣợc thể hiện ở hình 3.4 và bảng 4 (phần phụ lục)
Kết quả hình 3.4 cho thấy ở 500
C và 550C hoạt tính của lipozyme TL100Lđều tăng theo thời gian phản ứng và đạt hoạt tính rất cao ở nhiệt độ 55o
C (20982,7 U/mg protein). Hoạt tính enzym chỉ tăng trong khoảng thời gian đầu từ 3 giờ đến 5 giờ đối với nhiệt độ 65oC hoặc 3 đến 7 giờ khi ở nhiệt độ 60oC. Sau các thời điểm này cả hai mức nhiệt độ này hoạt tính enzym bắt đầu giảm khi thực hiện phản ứng trong vòng 24 giờ. Điều này có thể giải thích khi tăng nhiệt độ khá cao trong thời gian dài sẽ làm cho một số liên kết hiđro trong mạng lƣới liên kết hiđro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc của enzym bị đứt gãy.
Nhƣ vậy, Lipozyme TL100L ở nhiệt độ 650C đạt hoạt tính cao nhất tại thời điểm 5 giờ (19031,4 U/mg protein), nhƣng ổn định và bền chỉ ở nhiệt độ 50-55oC trong thời gian 24 giờ. Vì vậy khi thực hiện phản ứng transeste hóa xúc tác lipase từ chủng
Thermomyces lanuginosus cần thực hiện trong khoảng nhiệt độ từ 500
C đến 550
C do các phản ứng này thƣờng kéo dài thời gian trên 24 giờ mới có thể đạt hiệu suất chuyển hóa cao.
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính của lipase
Ion kim loại thƣờng ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzym. Đối với lipase là enzym 1 cấu tử nên ion kim loại không tham gia vào thành phần cấu trúc mà tác dụng chủ yếu
hoặc tham gia cầu nối kết hợp cơ chất với enzym. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính của lipase đƣợc trình bày qua hình 3.5 và bảng 5 (phần phụ lục).
Kết quả thể hiện hình 3.5 cho thấy: ion Ca2+ có tác dụng tăng hoạt tính lipase, đặc biệt Ca2+
giúp lipase tăng đến 13,9% hoạt tính. Hoạt tính lipase bị kìm hãm bởi các cation Pb2+, Cu2+ và EDTA.
Nhƣ vậy trong phạm vi phòng thí nghiệm khi thực hiện phản ứng transeste hóa xúc tác của lipase, có thể hoạt hóa enzym bằng CaCl2 10mM cho vào hỗn hợp phản ứng với tỷ lệ 1:1 trƣớc khi tiến hành phản ứng để làm tăng thêm hoạt tính xúc tác giúp phản ứng xảy ra hiệu quả hơn.
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của metanol và etanol đến hoạt tính của lipase
Các dung môi metanol và etanol là những chất làm giảm hằng số điện môi của nƣớc, ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt tính enzym. Vì vậy thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng hai dung môi này lên hoạt tính lipozyme TL100L đƣợc thực hiện nhằm đánh giá mức độ ức chế và có những định hƣớng phản ứng nhằm khắc phục nhƣợc điểm này khi sử dụng lipase làm xúc tác phản ứng transeste hóa. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng 6, bảng 7, bảng 8, bảng 9 (phần phụ lục) và hình 3.6.
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính lipase
CaCl2 PbCl2 CuSO4 EDTA Mẫu đối
Qua kết quả hình 3.6 nhận thấy khi ủ enzym với metanol và etanol (TN3 và TN4) hoặc thêm trực tiếp metanol và etanol (TN1 và TN2) vào hỗn hợp phản ứng thì hoạt tính của enzym đều giảm đi. Đặc biệt là ủ enzym với metanol và etanol trong khoảng 15 phút thì hoạt tính enzym giảm mạnh. Càng tăng lƣợng metanol và etanol thì enzym càng bị ức chế và mất hoạt tính càng nhanh. Trong đó etanol ức chế và làm giảm hoạt tính enzym nhiều hơn metanol. Kết quả này cũng khá giống với nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Lê Sỹ Thanh và Quyền Đình Thi khi khảo sát ảnh hƣởng của metanol và etanol lên hoạt tính lipase chủng Geotrichum sp. DTQ – 26.3 thì cả metanol và etanol đều làm giảm hoạt tính lipase. Trong đó, etanol làm hoạt tính enzym giảm đi khoảng hai phần ba, còn metanol làm hoạt tính giảm đi khoảng một phần ba [25]
.
Vậy khi tiến hành phản ứng transeste hóa với xúc tác enzym lipase nên sử dụng metanol hơn là etanol và đặc biệt là không ủ enzym với metanol trƣớc khi phản ứng mà nên chia nhỏ lƣợng metanol ra và thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng ở các thời điểm thích hợp.
3.3. Khảo sát phản ứng transeste hóa xúc tác Lipozyme TL100L
3.3.1. Ảnh hưởng của lượng xúc tác enzym
Khi thực hiện phản ứng transeste hóa với xúc tác lipase, yếu tố quan trọng nhất liên quan đến hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm chính là lƣợng xúc tác enzym. Vì vậy thí nghiệm đƣợc thực hiện ở các tỉ lệ enzym/dầu khác nhau từ 6-16%
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của dung môi đến hoạt tính lipase
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 0:1
Qua đồ thị hình 3.7 và bản sắc ký hình 3.8 nhận thấy với tỉ lệ xúc tác enzym/dầu là 6% thì phản ứng xảy ra không hiệu quả, hiệu suất chuyển hóa của phản ứng thấp (39,9%) sản phẩm còn lẫn nhiều dầu. Khi tăng tỉ lệ xúc tác lên 8-12% thì phản ứng xảy ra theo chiều hƣớng tốt. Enzym có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng giúp cho phản ứng transeste hóa xảy ra dễ dàng hơn và làm hiệu suất chuyển hóa tăng lên. Khi tăng tỉ lệ enzym và dầu lên 14% thì hiệu suất chuyển hóa của phản ứng đạt cao nhất (60,9%). Tiếp tục tăng tỉ lệ xúc tác lên 16% thì hiệu suất chuyển hóa không tăng mà có khuynh