3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Khảo sát phản ứng transeste hóa xúc tác Lipozyme TL100L
3.3.1. Ảnh hưởng của lượng xúc tác enzym
Khi thực hiện phản ứng transeste hóa với xúc tác lipase, yếu tố quan trọng nhất liên quan đến hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm chính là lƣợng xúc tác enzym. Vì vậy thí nghiệm đƣợc thực hiện ở các tỉ lệ enzym/dầu khác nhau từ 6-16%
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của dung môi đến hoạt tính lipase
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 0:1
Qua đồ thị hình 3.7 và bản sắc ký hình 3.8 nhận thấy với tỉ lệ xúc tác enzym/dầu là 6% thì phản ứng xảy ra không hiệu quả, hiệu suất chuyển hóa của phản ứng thấp (39,9%) sản phẩm còn lẫn nhiều dầu. Khi tăng tỉ lệ xúc tác lên 8-12% thì phản ứng xảy ra theo chiều hƣớng tốt. Enzym có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng giúp cho phản ứng transeste hóa xảy ra dễ dàng hơn và làm hiệu suất chuyển hóa tăng lên. Khi tăng tỉ lệ enzym và dầu lên 14% thì hiệu suất chuyển hóa của phản ứng đạt cao nhất (60,9%). Tiếp tục tăng tỉ lệ xúc tác lên 16% thì hiệu suất chuyển hóa không tăng mà có khuynh hƣớng làm giảm việc sinh ra metyl este.
Hình 3.8: Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các lƣợng enzym xúc tác khác nhau
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của lƣợng enzym xúc tác đến hiệu suất chuyển hóa metyl este
Kết quả trên cho thấy khi điều chế metyl este với xúc tác Lipozyme TL100L ở dạng tự do ta cần tiêu tốn một lƣợng enzym khá lớn trong khi đó hiệu suất chuyển hóa của phản ứng lại không cao và sản phẩm metyl este vẫn còn lẫn khá nhiều dầu. Nguyên nhân có thể do bề mặt tiếp xúc của xúc tác enzym và dầu chƣa tốt, mặc khác enzym chƣa đƣợc cố định ở dạng tự do dễ dàng bị mất hoạt tính khi trực tiếp phản ứng với metanol. Nếu đƣợc cố định enzym thì hiệu suất chuyển hóa metyl este sẽ cao hơn rất nhiều [8], [22], [9]
.
3.3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ mol metanol/dầu
Yếu tố quan trọng nhất liên quan trực tiếp đến hoạt tính enzym lipase trong phản ứng transeste hóa là lƣợng dung môi metanol tác dụng. Vì vậy thí nghiệm đƣợc thực hiện ở các tỉ lệ mol metanol: dầu khác nhau. Kết quả ghi nhận ở hình 3.9 và 3.10.
Hình 3.10: Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các tỉ lệ mol metanol/dầu ăn Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỉ lệ mol metanol/dầu ăn đã
qua sử dụng đến hiệu suất chuyển hóa metyl este
2:1 4:1 6:1 8:1 10:1 12:1 14:1
Căn cứ vào hình 3.9 và 3.10 ở trên ta nhận thấy: với tỉ lệ mol metanol/dầu là 3:1 thì hiệu suất chuyển hóa của phản ứng không cao. Khi tăng dần tỉ lệ mol metanol/dầu lên 8:1 và 10:1 thì phản ứng xảy ra khá tốt, khối lƣợng metyl este tăng đạt hiệu suất chuyển hóa lần lƣợt là 62,09% và 61,89%. Tuy nhiên ở tỉ lệ mol metanol/dầu 10:1 sản phẩm metyl este thu nhận không đƣợc sạch nhƣ ở tỉ lệ 8:1. Nhƣ vậy, tỉ lệ mol metanol/dầu ăn đã qua sử dụng trong thí nghiệm cũng khá phù hợp với tỉ lệ metanol/dầu nành khi thực hiện phản ứng transeste với xúc tác lipase từ chủng
Thermomyces lanuginosus của Rafel.C.R (2009) [21], tác giả đã sử dụng tỉ lệ 7,5:1 và
hiệu suất chuyển hóa của phản ứng đạt khoảng 20%.
Khi tiếp tục tăng tỷ lệ mol metanol/dầu lên 12:1 thì hiệu suất chuyển hóa phản ứng giảm xuống. Điều này có thể giải thích do lƣợng metanol quá nhiều đã ức chế hoạt tính xúc tác của enzym. Do đó, việc sử dụng metanol cần đúng liều lựợng, tránh sử dụng nhiều có thể làm giảm mất hoạt tính enzym đồng thời ảnh hƣởng đến giá thành sản phẩm.
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Trong quá trình thực hiện phản ứng transeste hóa với xúc tác lipase, yếu tố thời gian đóng vai trò rất quan trọng nhất liên quan đến hiệu suất chuyển hóa sản phẩm tạo thành. Vì vậy thí nghiệm đƣợc thực hiện ở các thời gian phản ứng khác nhau. Kết quả ghi nhận ở hình 3.11 và 3.12.
Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất chuyển hóa metyl este
Dựa vào hình 3.11 và 3.12 ta thấy thời gian thực hiện phản ứng điều chế metyl este với xúc tác Lipozyme TL100L khá dài. Ở thời gian phản ứng là 24 giờ thì chƣa đủ thời gian để chuyển hóa hoàn toàn lƣợng dầu ăn thành sản phẩm, hiệu suất chuyển hóa điều chế metyl este còn thấp và còn lẫn nhiều dầu đƣợc thể hiện trên bản sắc ký. Khi tăng thời gian phản ứng lên 28 giờ nhận thấy hiệu suất chuyển hóa phản ứng giảm nhƣng lƣợng metyl este thu đƣợc lại sạch hơn. Nguyên nhân làm cho hiệu suất chuyển hóa ở 24 giờ cao hơn có thể do sản phẩm metyl este còn lẫn nhiều dầu và lƣợng dầu này khó tách ra khỏi hỗn hợp làm tăng khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Khi tiếp tục tăng thời gian phản ứng lên 32 giờ và 36 giờ thì đồng thời lƣợng sản phẩm thu đƣợc cũng tăng lên và sản phẩm cũng khá sạch hơn 24 giờ và 28 giờ.
Theo nghiên cứu của Funda Yagiz và cộng sự [8]
khi sử dụng lipase tự do từ chủng Thermomyces lanuginosus để thực hiện phản ứng traneste hóa trên nguồn dầu ăn trong khoảng thời gian từ 22 giờ đến 105 giờ thì thấy khối lƣợng metyl este tăng theo thời gian phản ứng. Hiệu suất chuyển hóa phản ứng khá thấp (dƣới 40%) trong khoảng từ 22 giờ đến 40 giờ và hiệu suất chuyển hóa cao nhất là ở 105 giờ đạt 95%. Trong khi đó, hiệu suất đạt khá cao khi enzym đƣợc cố định trên hidrotalcite và zeolit. Nghiên cứu của Hong Wu và các cộng sự [9]
khi sử dụng enzym lipase từ
Thermomyces lanuginosus cũng cho kết quả tƣơng tự. Điều này cho thấy khi sử dụng
lipase ở dạng tự do để làm xúc tác cho phản ứng traneste hóa thì thời gian phản ứng kéo dài. Để đạt hiệu suất chuyển hóa cao và rút ngắn thời gian phản ứng thì lipase nên đƣợc cố định trên chất mang thích hợp.
Vì thời gian thí ngiệm có hạn nên đề tài chỉ tiến hành khảo sát thí nghiệm thời
Hình 3.12: Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các thời gian phản ứng khác nhau
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Qua các kết quả ở trên chúng tôi rút ra đƣợc những kết luận sau đây:
Enzym lipozyme TL100L thƣơng mại từ chủng Thermomyces lanuginosus hoạt động tốt với cơ chất là dầu ăn đã qua sử dụng trong khoảng pH từ 7-8, nhiệt độ tối ƣu là 650C, bền trong khoảng nhiệt độ từ 500C đến 550C. Ở nồng độ 10mM, cation Ca2+ có khả năng làm tăng hoạt tính của lipase và bị ức chế nhẹ bởi các cation Pb2+, Cu2+ và EDTA. Cả hai dung môi metanol và etanol đều làm giảm hoạt tính của enzym với các mức độ khác nhau.
Khi thực hiện phản ứng transeste hóa dầu ăn đã qua sử dụng với xúc tác lipozyme TL100L thƣơng mại ở nhiệt độ phản ứng 55oC, tỉ lệ enzym/dầu ăn khoảng 14%, tỉ lệ mol metanol/dầu ăn là 8:1 trong thời gian 36 giờ thì phản ứng điều chế metyl este đạt hiệu suất chuyển hóa cao nhất 61,43% và sản phẩm metyl este trên sắc ký bản mỏng tƣơng đối sạch.
4.2. Kiến nghị
Do hạn chế về thời gian và điều kiện phòng thí nghiệm nên đề tài cần tiếp tục nghiên cứu một số vấn đề sau:
Phân tích thành phần hóa học sản phẩm metyl este bằng kỹ thuật sắc ký khí để đánh giá chính xác hiệu quả phản ứng.
Thử nghiệm phản ứng transeste hóa sử dụng xúc tác enzym lipase đƣợc cố định trên các chất mang khác nhằm làm tăng hiệu suất của phản ứng và tái sử dụng enzym đƣợc nhiều lần để giảm giá thành sản phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Adriano A. Mendes; Heizir F. de Castro; Raquel de L. C. Giordano (2013),
Screening of organic supports and activation protocols for immobilization and stabilization of lipase from Thermomyces lanuginosus.
[2] Arpigny, J.L. and Jaeger, K.J. (1999), “Bacterial lipolytic enzyms:
classification and properties”, Biochemical Journal, 343, pp. 177-183.
[3] Beisson, F., Tiss, A., Rivière, C. and Verger, R. (2000), “Methods for
lipase detection and assay: a critical review”, European Journal of Lipid Science and
Technology, pp. 133–153.
[4] Brenda Rogelina Cruz-Ortiz, Leopoldo Javier Ríos-González, Yolanda Garza García, José Antonio Rodríguez de la Garza, and Jesús Rodríguez-Martínez (2011),
Immobilization of Thermomyces lanuginosus Lipase in PVA-alginate Beads, J. Mex.
Chem. Soc, 55(3), 176-180.
[5] Brockerhoff, H. and Jensen, R. (1974), Lipolytic enzyms, Academic Press, New York.
[6] Dƣơng Thị Phụng Các (2004), Bước đầu phân lập các vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy lipid, Khóa luận cử nhân khoa học, Công nghệ Sinh học Công nghiệp, Ngành Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp. HCM.
[7] Chevron Product Company (2007), Diesel Fuels Technical Review, Chevron Corporation, U.S.A.
[8] Funda Yagiz, Dilek Kazan, A. Nilgun Akin (2003), Biodiesel production from
waste oils by using lipase immobilized on hydrotalcite and zeolites, Chemical
Engineering Journal 134, pp. 262–267.
[9] Hong Wu, Min-hua Zong, Qian Luo, and Hua-chang Wu, Enzymatic conversion of waste oil to Biodiesel in a solvent-free system, pp. 533-534.
[10] Ghosh, P. K., Saxena, T. K., Gupta, R., Yadav, R. P. and Davidson, S. (1996),
“Microbial lipases: Production and application”, Science Program 79, pp. 119-157.
[11] Lê Thanh Hòa, Quyền Đình Thi (2006), Y sinh học phân tử, Chương IX: Lipase
vi sinh vật: sinh tổng hợp, tinh sạch, xác định tính chất sinh học, Quyển I, NXB Y học,
[12] Holmes, P.E. and Hamden, C. (1989), “Identification, characterization, and method of production of a novel microbial lipase”, United States Patent, patent number 5,063,160.
[13] Lê Quang Huy (2008), Khảo sát hoạt tính enzym triglyceride lipase của nấm
men Schizosacchromyces pombe, Khóa luận cử nhân khoa học, Chuyên ngành
Sinh hóa, Ngành Sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp. HCM.
[14] Jaeger, K.E., Ransac, S., Dijkstra, B.W., Colson, C., Margreet van Heuvel, M.V. and Misset, O. (1994), “Bacterial lipases”, FEMS Microbiology Reviews,
15, pp. 29-63.
[15] Nguyễn Anh Khoa (2010), Đồ án môn học chuyên nghành “Sản xuất biodiesel
từ nguyên liệu có nguồn gốc dầu mỡ động thực vật”.
[16] Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology (2005), Enzym applications, industrial, Copyright John Wiley & Sons, Inc., 10, pp. 248 – 317. [17] Lê Thị Hƣơng Lan (2011), Luận văn tốt nghiệp “Điều chế metyl este từ dầu ăn
đã qua sử dụng bằng phương pháp nhiệt – xúc tác axit”, trƣờng Đại học Cần Thơ.
[18] Ths. Phùng Minh Lộc – KS. Hồ Đức Tuấn, Nghiên Cứu sử dụng dầu thực vật
Việt Nam là nhiên liệu cho diesel cỡ nhỏ, Tạp chí khoa học – Công nghệ thủy sản,
trang 51, số 01/2008.
[19] Trƣơng Minh Mẫn (2009), luận văn thạc sĩ sinh học “ Bƣớc đầu khảo sát vi sinh vật có khả năng tổng hợp lipase ngoại bào”, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp. HCM.
[20] Praphan Pinsirodom and Kirk L. Parkin (2001), “Lipolytic Enzym”, Food Analytical Chemistry, C3.1.1 - C3.1.13.
[21] Rafel.C.R (2009), “Síntese de biodiesel através de tranesteificaC¸ ão enzimática de óleos vegletais catalisada por lipase imobilizada por ligaC¸ ão covalente multipontual”.
[22] Abu Bakar Salleh, Raja Noor Jaliha Raja Abdul Rahman, Mahiran Basri (2006), New Lipase and Proteases, Nova Science Publishers, V.1-22, pp.41-61. [23] Saxena, R.K., Ghosh, P.K., Gupta, R., Davidson, W.S., Bradoo, S. and Gulati,
R. (1999), “Microbial lipases: Potential biocatalysts for the future industry”, Current Science,77(1), pp. 101-115.
[24] Sharma, R., Chisti, Y. and Banerjee, U.C. (2001), “Research review paper –
Production, purification, characterization, and applications of lipases”,
Biotechnology Advances, 19, pp. 627–662.
[25] Shweta Shah, Shweta Sharma and M N Gupta (2003), Enzymatic transesteification for biodiesel production, Indian Journal of Biochemistry & Biophysic Vol.40, pp. 392-399.
[26] Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2007), Một số tính chất hóa lý của
lipase ngoại bào chủng Geotrichum SP. DTQ-26.3, Tạp chí Công nghệ Sinh học
5(1): 31-40, 2007.
[27] Quyền Đình Thi (2004), “Những ứng dụng của lipase vi sinh vật”, Báo cáo Khoa học, Hội nghị Khoa học, Hóa sinh Y dƣợc năm 2004, Hà Nội,8, tr. 23-136. [28] Đặng Thị Thu, Ngô Tiến Hiển và cộng sự (2004), “Nghiên cứu công nghệ sản
xuất một số loại dầu béo bằng lipaza”, Đề tài nhánh của nghiên cứu cấp nhà nƣớc
mã số: KC 04-07, Viện Công Nghệ Thực Phẩm.
[29] Vakhlu, J. and Kout, A. (2006), “Yeast lipases: enzym purification, biochemical properties and gene cloning”, Electronic journal of biotechnology, 9(1), pp. 69-85. [30] http://en.wikipedia.org/wiki/Biodiesel
[31] http://hoahocngaynay.com/vn/nghien-cuu-giang-day/bai-nghien-cuu/320- diesel-sinh-hoc-va-trien-vong-phat-trien.html
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 2
Bảng 1: Tương quan giữa giá trị OD595 và nồng độ albumin
Nồng độ BSA (µg/ml)
0 60 120 180 240 300
OD595 -0,010 0,212 0,347 0,470 0,642 0,811
Bảng 2: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipozyme TL100L
pH Hoạt tính chung (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg protein) 6,0 42318,88 3238,36 6,5 45172,16 3456,70 7,0 51574,43 3946,62 7,5 55034,05 4211,36 8,0 56425,14 4317,81 8,5 42853,89 3279,30 9,0 33419,97 2557,39
Bảng 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipozyme TL100L
Nhiệt độ (C) Hoạt tính chung (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg protein) 35 44550,38 3409,12 40 48850,41 3738,17 45 53250,40 4074,87 50 54900,37 4201,13 55 57200,47 4377,14 60 86850,71 6646,06 65 107525,86 8228,18 70 71050,59 5368,12
Bảng 4: Độ bền nhiệt độ theo thời gian của lipozyme TL100L Nhiệt độ (C) Thời gian (giờ) Hoạt tính chung (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg protein) 50 3 154633,3 11833,1 5 166733,3 12759,0 7 175133,3 13401,8 24 209350,0 16020,2 55 3 167800,0 12840,6 5 218066,7 16687,2 7 238133,3 18222,8 24 274200,0 20982,7 60 3 210833,3 16133,7 5 233550,0 17872,0 7 242225,0 18535,9 24 209100,0 16001,0 65 3 224300,0 17164,2 5 248700,0 19031,4 7 238700,0 18266,1 24 207200,0 15855,6
Bảng 5: Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính lipozyme TL100L
Mẫu Hoạt tính chung (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg protein) % Hoạt tính (%) Mẫu đối chứng 154933,3 11855,9 100 CaCl2 176400,0 13498,6 113,9 PbCl2 135166,7 10343,3 87,2 CuCl2 119500,0 9144,5 77,1 EDTA 128700,0 9848,5 83,1
Bảng 6: Ảnh hưởng của metanol đến hoạt tính lipozyme TL100L
Tỉ lệ mol metanol:dầu
Hoạt tính chung (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg protein)
TN3 TN1 TN3 TN1 0:1 135000,00 135000,00 10330,58 10330,58 3:1 119400,00 121866,67 9136,82 9325,58 4:1 103966,67 119233,33 7955,82 9108,76 5:1 61966,67 107500,00 4741,86 8226,20 6:1 57666,67 101233,33 4412,82 7746,66
Bảng 7: Hoạt tính còn lại của lipozyme TL100L
Bảng 8: Ảnh hưởng của etanol đến hoạt tính lipozyme TL100L
Tỉ lệ mol etanol:dầu
Hoạt tính chung (U/ml) Hoạt tính riêng (U/mg protein)
TN4 TN2 TN4 TN2 0:1 135000,00 135000,00 10330,58 10330,58 3:1 93300,00 110833,33 7139,58 8481,28 4:1 91266,67 107600,00 6983,98 8233,85 5:1 88900,00 105400,00 6802,88 8065,50 6:1 86400,00 102833,33 6611,57 7869,09
Tỉ lệ mol metanol : dầu % Hoạt tính (%)
TN3 TN1 0:1 100,00 100,00 3:1 88,44 90, 27 4:1 77,01 88,17 5:1 45,90 79,63 6:1 42,72 74,99
Bảng 9: Hoạt tính còn lại của lipozyme TL100L
Bảng 10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác enzym đến hiệu suất chuyển
hóa của phản ứngđiều chế metyl este
Tỉ lệ % (v/w) enzym/dầu
ăn đã qua sử dụng 6% 8% 10% 12% 14% 16% Khối lƣợng metyl este
trung bình (g) 4,01 5,53 5,66 5,85 6,12 6,04 Khối lƣợng metyl este lý
thuyết (g) 10,05
Hiệu suất chuyển hóa (%) 39,90 54,98 56,32 58,21 60,90 60,05
Bảng 11: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol metanol/dầuđến
hiệu suất chuyển hóa metyl este
Tỉ lệ mol metanol/dầu ăn đã
qua sử dụng 3:1 6:1 8:1 10:1 12:1 Khối lƣợng metyl este trung
bình (g) 4,30 6,08 6,24 6,22 5,58 Khối lƣợng metyl este lý
thuyết (g) 10,05
Hiệu suất chuyển hóa (%) 42,74 60,45 62,09 61,89 55,52 Tỉ lệ mol etanol:dầu % Hoạt tính (%)
TN4 TN2 0:1 100,00 100,00 3:1 69,11 82,10 4:1 67,60 79,70 5:1 65,85 78,07 6:1 64,00 76,17
Bảng 11: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gianđến hiệu suất chuyển hóa metyl este
Thời gian (giờ) 24 28 32 36
Khối lƣợng metyl este trung
bình (g) 4,13 3,67 5,53 6,04 Khối lƣợng metyl este lý
thuyết (g) 10,05
PHỤ LỤC 3
Dầu ăn sau khi lọc bỏ cặn Đun hoàn lƣu
Làm khan sản phẩm bằng Na2SO4
Làm khan sản phẩm bằng Silicagen