5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
2.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6.1. Phương pháp nghiên cứu huấn luyện và khai thác tinh trâu Việt Nam
2.6.1.1. Phương pháp huấn luyện khai thác tinh
- Sử dụng phương pháp khai thác tinh bằng âm đạo giả để khai thác tinh trâu Việt Nam. Các bước huấn luyện và khai thác tinh trâu Việt Nam như sau:
+ Làm quen với không gian, địa điểm nơi lấy tinh: Mỗi tuần 3 lần, 06 trâu đực được dắt từ chuồng tới nơi khai thác tinh buộc vào giá cho quan sát địa điểm, không gian…, các tác nghiệp chuẩn bị khai thác tinh (tắm, chải, thụt rửa bao dương vật....). Kết thúc giai đoạn làm quen khi trâu huấn luyện có biểu hiện bắt chước nhảy giá.
+ Chuẩn bị giá nhảy: Chọn trâu khoẻ mạnh tầm vóc tương xứng với trâu đực huấn luyện để lấy tinh, cột cố định vào gióng, vệ sinh sạch sẽ cơ thể đặc biệt là phần mông và đuôi.
+ Huấn luyện nhảy giá: Thời gian huấn luyện vào lúc trời mát (đầu buổi sáng hoặc cuối buổi chiều). Khi trâu đực được huấn luyện nhảy lên giá, người huấn luyện nhanh chóng cầm lấy dương vật kích thích để trâu tiết ra tinh thanh vệ sinh đường niệu đạo. Cho trâu nhảy nhứ 2-3 lần trước khi lấy tinh (tinh thanh ra trước rửa niệu đạo, đồng thời tăng được lượng tinh dịch cho một lần khai thác) sau đó mới đưa vào âm đạo giả đã chuẩn bị trước để chúng có phản
xạ xuất tinh. Tiến hành tập luyện cho trâu đực nhảy giá mỗi tuần 3 lần cho đến khi trâu đực thành thạo nhảy giá và khai thác tinh bằng âm đạo giả.
+ Chuẩn bị âm đạo giả: Lồng ruột âm đạo vào trong vỏ và dùng đai cao su đai chắc hai đầu, sau đó lắp phễu và ống hứng tinh cho chắc chắn. Dán tem có ghi số hiệu trâu đực cần lấy tinh vào ống hứng tinh và vào vỏ âm đạo giả. Đổ nước ấm 420C qua lỗ van với lượng nước 500ml và lắp van lại. Dùng đũa thủy tinh vô trùng bôi vaseline đều vào khoảng 1/3 trong lòng âm đạo giả. Dùng bơm cầu bóp cao su lắp vào đầu van và bơm khí vào cho tới khi ruột âm đạo nở căng tạo từ 3 đến 4 múi rồi khoá van lại.
2.6.1.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
- Tuổi bắt đầu huấn luyện khai thác tinh và tuổi bắt đầu khai thác tinh của trâu Việt Nam được theo dõi, ghi chép thông qua hồ sơ lý lịch của từng trâu đực.
- Khối lượng của trâu Việt Nam được xác định bằng cân điện tử.
- Thời gian huấn luyện khai thác tinh của trâu Việt Nam được theo dõi, ghi chép từ khi bắt đầu đưa vào huấn luyện khai thác tinh đến khi trâu đực nhảy giá thành thục và khai thác được tinh dịch trâu bằng âm đạo giả.
2.6.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của cá thể và mùa vụ đến một số chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh trâu Việt Nam
2.6.2.1. Phương pháp khai thác tinh dịch
- Thời gian khai thác tinh: từ 7 giờ đến 8 giờ - Tần suất khai thác tinh dịch: 2 lần/tuần
- Chuẩn bị âm đạo giả: Các bộ phận của âm đạo giả, đã được khử trùng rồi lắp ráp và bảo quản trong tủ ấm 420C trước khi lấy tinh.
- Chuẩn bị trâu đực: Những trâu đực đến ngày khai thác tinh được tắm sạch sẽ và thụt rửa bao dương vật trước khi khai thác tinh 30 phút bằng nước muối sinh lý 0,9%.
- Chuẩn bị trâu giá: Chọn trâu giá thích hợp, vệ sinh cơ thể trâu sạch sẽ và cho vào giá.
- Lấy tinh: Kích thích cho trâu đực giống hưng phấn sinh dục, rồi cho nhảy trâu giá và lấy tinh bằng âm đạo giả.
- Mẫu tinh dịch khai thác được đưa ngay vào phòng thí nghiệm và đặt trong bể nước ấm 350C để kiểm tra các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch. Ở mỗi cá thể trâu đực giống, lấy số liệu của 120 mẫu tinh dịch, mỗi mùa vụ trong năm lấy 30 mẫu tinh dịch và thực hiện trong 2 năm nghiên cứu. Tổng cộng có 720 mẫu tinh dịch trâu Việt Nam được đánh giá một số chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh trâu.
2.6.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
- Lượng xuất tinh: Xác định bằng cách quan sát trên ống nhựa có chia vạch khắc ml.
- Hoạt lực tinh trùng: Dùng micropipét hút 0,01 ml tinh dịch + 0,09 ml dung dịch A (môi trường pha loãng tinh dịch không có glycerol) rồi nhỏ lên phiến kính chuyên dụng và được giữ ấm ở nhiệt độ 380C, đậy la men rồi đưa lên kính hiển vi phản pha có có gắn camera phóng đại 100 lần kết nối với màn hình. Hoạt lực tinh trùng được đánh giá bởi 03 chuyên gia độc lập, giá trị hoạt lực là giá trị trung bình của các chuyên gia đánh giá (Jainudeen và cs., 1982; Beheshti và cs., 2011). Hoạt lực tinh trùng được kiểm tra ngay sau khi khai thác tinh dịch.
- Nồng độ tinh trùng: Dùng micropipét hút 0,02ml tinh dịch pha loãng trong 4ml nước muối sinh lý 0,9%, lắc nhẹ cho đều và đưa vào máy Photometer SDM5 (Minitub, Đức). Chỉ số hiện trên máy là nồng độ tinh trùng (tỷ/ml).
- Tổng số tinh trùng sống tiến thẳng: Xác định bằng tích của lượng xuất tinh, hoạt lực tinh trùng và nồng độ tinh trùng (VAC = VxAxC).
- pH tinh dịch: Xác định bằng máy đo pH (Minitub, Đức).
- Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: Sử dụng Fucsin 5% nhuộm tinh trùng từ 5 đến 7 phút, phết lam kính và soi trên kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần. Đếm số lượng tinh trùng kỳ hình và không kỳ hình, tổng số 500 tinh trùng, rồi tính toán bằng phép tính số học thông thường theo công thức sau:
K (%) = Số lượng tinh trùng kỳ hình x 100 500
- Tỷ lệ tinh trùng sống (%): Xác định theo phương pháp của Blom (1950), nhỏ 1 giọt tinh dịch lên lam kính lõm và 2 giọt Eosin 5%, đảo nhẹ, sau đó nhỏ 4 giọt Nigrosin 10%, đảo nhẹ, để ấm 370C trong 30 giây. Lấy 1 giọt tinh dịch đã nhuộm phết kính dàn mỏng đều đưa lên kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Đếm tổng số 500 tinh trùng gồm cả tinh trùng sống và tinh trùng chết (tinh trùng chết là những tinh trùng bắt màu đỏ Eosin). Tính tỷ lệ tinh trùng sống bằng phép tính số học thông thường theo công thức sau:
Tỷ lệ tinh trùng sống (%) = Số lượng tinh trùng sống500 x 100
2.6.3. Phương pháp nghiên cứu lựa chọn môi trường pha loãng và phương pháp đông lạnh tinh trâu Việt Nam
2.6.3.1. Chuẩn bị mẫu
- Sử dụng 120 mẫu tinh dịch của 04 trâu đực giống số hiệu 301, 302, 304 và 305 (mỗi trâu đực khai thác tinh 30 lần), do các trâu đực có sự đồng đều về độ tuổi khai thác tinh, sự thành thục nhảy giá khai thác tinh và đồng đều về một số chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh. Các mẫu tinh dịch đưa vào thí nghiệm này đảm bảo đạt tiêu chuẩn lượng xuất tinh không nhỏ hơn 1ml, hoạt lực tinh trùng không nhỏ hơn 70%, nồng độ tinh trùng không nhỏ hơn 0,6 tỷ/ml, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình không lớn hơn 20%, tỷ lệ tinh trùng sống không nhỏ hơn 70%
(Herdis và cs., 1999; Koonjaenak, 2006; Vale, 2010; Ansari và cs., 2011, Swelum và cs., 2011, El-Kon, 2011).
- Ở các lần khai thác, các mẫu tinh dịch đạt tiêu chuẩn của từng trâu đực được trộn chung với nhau (Rasul và cs., 2000, Swelum và cs., 2011), sau đó được chia làm 6 phần bằng nhau để thí nghiệm với 3 môi trường khác nhau và 2 phương pháp đông lạnh khác nhau.
2.6.3.2. Môi trường pha loãng
- Môi trường thí nghiệm: Sử dụng 03 môi trường thí nghiệm như sau: i) Môi trường 1 (MT1) của Pakistan có 1,21g Tris, 0,67g axit
Citric, 1,04g Natri citrate, 0,25g Fructose, 0,25g Glucose, 1g Lactose, 100.000UI Penicillin G, 100mg Streptomycin, 7% glycerin, 20% lòng đỏ trứng gà và nước cất vừa đủ 100ml (Siddique và cs., 2006);
ii) Môi trường 2 (MT2) của Ấn Độ có 3,028g Tris, 1,675g axit Citric, 1,25g Fructose, 100.000UI Penicillin G, 100mg Streptomycin, 7% glycerin, 15% lòng đỏ trứng gà và nước cất vừa đủ 100ml (Singh và cs., 1995);
iii) Môi trường 3 (MT3) của Nhật Bản có 1,363g Tris, 0,762g axit Citric, 0,375g Fructose, 1,5g Lactose, 2,7g Raffinose, 100.000UI Penicillin G, 100mg Streptomycin, 6,5% glycerin, 20% lòng đỏ trứng gà và nước cất vừa đủ 100ml (Đào Đức Thà và cs., 2007, 2010).
- Pha loãng môi trường: Các môi trường được pha làm 2 loại dung dịch, dung dịch A không có glycerin, dung dịch B gồm dung dịch A và glycerin theo tỷ lệ của từng môi trường.
- Pha loãng tinh dịch: Sử dụng các dung dịch A và B của môi trường pha loãng tinh dịch sao cho nồng độ tinh trùng đạt 0,12 tỷ/ml tương đương 30 triệu/cọng rạ 0,25ml (Ansari và cs., 2011).
- Làm mát và cân bằng glycerol: Giảm nhiệt độ tinh dịch xuống 40C trong 2h và tiếp tục cân bằng ở 40C trong 4 giờ (Shukla và Misra, 2007; Akhter và cs., 2011; Beheshti và cs., 2011; El-Kon, 2011; Sadeg và cs., 2011; Ansari và cs., 2011).
- Đóng gói tinh dịch: Sử dụng máy nạp hàn cọng rạ (hãng Minitub, Đức) để nạp tinh dịch vào cọng rạ 0,25ml (hãng IMV, Pháp), đồng thời sử dụng các loại cọng rạ có màu sắc khác nhau ở các lô thí nghiệm.
- Đông lạnh theo 2 phương pháp:
i) Phương pháp đông lạnh nhanh (PP1): Đặt cọng rạ trên khay nằm ngang cách bề mặt nitơ lỏng 4cm (nhiệt độ - 1200C) trong 10 phút, sau đó đưa ngay các cọng rạ ngập trong nitơ lỏng (-1960C) để bảo quản (El-Sheshtawy và cs., 2008, Akhter và cs., 2011; Ansari và cs., 2011).
ii) Phương pháp đông lạnh chậm, lập trình giảm nhiệt độ liên tục (PP2): Giảm nhiệt độ từ 40C xuống -60C với tốc độ giảm 30C/phút, từ -60C xuống -700C với thời gian 8 phút, từ -700C xuống -1650C với tốc độ giảm 240C/phút, sau đó đưa cọng rạ vào nitơ lỏng nhiệt độ -1960C. (Phùng Thế Hải và cs., 2011).
2.6.3.4. Xác định chất lượng tinh sau giải đông
- Sau 24h đông lạnh, lấy ngẫu nhiên 03 cọng rạ tinh đông lạnh của mỗi thí nghiệm, giải đông ở 370C trong 30 giây (Siddique và cs., 2006, Andrabi và cs., 2008b; Ansari và cs., 2011).
- Kiểm tra các chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng sau giải đông, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau giải đông và tỷ lệ tinh trùng sống sau giải đông bằng các phương pháp như đã trình bày ở mục 2.6.2.2.
Bảng 2.2. Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu lựa chọn môi trường pha loãng và phương pháp đông lạnh tinh trâu Việt Nam
Môi trường
Chất lượng tinh đông lạnh sau giải đông của trâu Việt Nam trong phương pháp PP1 hoặc PP2
Hoạt lực tinh trùng (%) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (%) Tỷ lệ tinh trùng sống (%)
MT1 Mean±SD Mean±SD Mean±SD
MT2 Mean±SD Mean±SD Mean±SD
MT3 Mean±SD Mean±SD Mean±SD
2.6.4. Phương pháp đánh giá khả năng sản xuất tinh đông lạnh dạng cọng rạ của trâu Việt Nam
2.6.4.1. Quy trình sản xuất tinh trâu đông lạnh dạng cọng rạ
- Đánh giá một số chỉ tiêu số lượng và chất lượng tinh dịch: Sử dụng 720 mẫu tinh dịch trâu Việt Nam ở nội dung 2.5.2, đánh giá một số chỉ tiêu số lượng chất lượng tinh dịch như đã trình bày ở mục 2.6.2.
- Tiêu chuẩn số lượng, chất lượng tinh dịch đưa vào sản xuất tinh đông lạnh dạng cọng rạ: Các lần khai thác tinh đưa vào sản xuất tinh đông lạnh cần phải đạt tiêu chuẩn gồm: hoạt lực tinh trùng không nhỏ hơn 70%, nồng độ tinh trùng không nhỏ hơn 0,6 tỷ/ml, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình không lớn hơn 20%, tỷ lệ tinh trùng sống không nhỏ hơn 70% (Herdis và cs., 1999; Koonjaenak, 2006; Vale, 2010; Ansari và cs., 2011, Swelum và cs., 2011, El Kon, 2011)
- Chuẩn bị môi trường pha loãng tinh dịch: Sử dụng môi trường tốt nhất ở thí nghiệm của nội dung 3 (mục 2.5.3), trình bày cụ thể ở mục 2.6.3.2, pha môi trường và bảo quản trong tủ bảo quản có nhiệt độ 50C. Trước khi sử dụng,
môi trường được lấy ra và đặt trong Autobath có nhiệt độ 350C để cân bằng nhiệt độ với nhiệt độ tinh dịch.
- In nhãn mác lên vỏ cọng rạ bằng máy in chuyên dùng (Linx 4900) với các chỉ số:
+ VN: là mã nước Việt Nam.
+ Tr 301: là trâu đực giống Việt Nam số hiệu 301. + NSX: là ngày sản xuất tinh 10/02/2012.
+ VINALICA: là thương hiệu Trung tâm giống gia súc lớn Trung ương. - Pha loãng tinh dịch, làm mát và cân bằng glycerol, đóng gói tinh dịch làm theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.6.3.3.
- Đông lạnh tinh trùng theo phương pháp đông lạnh tốt nhất ở thí nghiệm của nội dung 3 (mục 2.5.3), phương pháp cụ thể ở mục 2.6.3.3.
- Kiểm tra hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh: Sau khi đông lạnh 24 giờ, tinh cọng rạ được lấy mẫu ngẫu nhiên theo từng cá thể trâu đực giống, giải đông ở 370C trong 30 giây và kiểm tra hoạt lực tinh trùng theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.6.2.2, nếu hoạt lực A ≥ 40% thì đạt tiêu chuẩn.
- Bảo quản: Tinh cọng rạ đạt tiêu chuẩn thì được đóng vào ống 25 cọng rạ/ống và sắp vào cóng đựng tinh theo từng đực giống, từng ngày sản xuất (có ghi sơ đồ quản lý từng ngày sản xuất và của từng đực giống) và bảo quản trong bình chuyên dụng chứa đầy nitơ lỏng (-1960C).
2.6.4.2. Phương pháp đánh giá khả năng sản xuất tinh đông
- Tỷ lệ các lần khai thác tinh đạt tiêu chuẩn ở từng chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch được tính toán theo phép tính số học thông thường:
Tỷ lệ ĐTC (%) = Số lần khai thác tinh ĐTCTổng số lần khai thác tinh x 100
- Các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch đạt tiêu chuẩn, số lượng tinh sản xuất và số lượng tinh cọng rạ sản xuất đạt tiêu chuẩn được tính toán theo từng cá thể, từng mùa vụ bằng phép tính số học thường quy sau khi đưa mẫu tinh dịch trâu đạt tiêu chuẩn vào sản xuất tinh đông lạnh.
2.6.5. Phương pháp kiểm nghiệm chất lượng tinh đông lạnh dạng cọng rạ của trâu Việt Nam
2.6.5.1. Phương pháp đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải
đông
- Hoạt lực tinh trùng sau giải đông (%) được xác định sau khi bảo quản tinh đông lạnh 24 giờ, lấy kiểm tra ngẫu nhiên 1 cọng rạ của từng lô tinh cọng rạ của từng lần khai thác tinh đạt tiêu chuẩn của từng trâu đực, giải đông ở nhiệt độ 37°C trong 30 giây, kiểm tra hoạt lực tinh trùng trên kính hiển vi phản pha có màn hình như đã trình bày ở mục 2.6.2.2.
2.6.5.2. Phương pháp xác định tỷ lệ thụ thai ở lần phối đầu bằng tinh đông lạnh cọng rạ của từng trâu Việt Nam
- Xác định tỷ lệ thụ thai ở lần phối đầu bằng tinh đông lạnh cọng rạ của từng trâu Việt Nam với đàn trâu cái địa phương cụ thể như sau:
+ Tinh cọng rạ của 6 trâu Việt Nam được lấy ngẫu nhiên ở các lô sản xuất trong các bình nitơ bảo quản tinh đông lạnh. Tinh cọng rạ đảm bảo tiêu chuẩn hoạt lực tinh trùng sau giải đông không nhỏ hơn 40%. Mỗi trâu đực sử dụng 25 cọng rạ đạt tiêu chuẩn để phối TTNT với 25 trâu cái địa phương, tổng cộng sử dụng 150 cọng rạ tinh trâu đông lạnh phối TTNT cho 150 trâu cái.
+ Dẫn tinh viên là người đã và đang làm công tác TTNT tại cơ sở đều được đào tạo cơ bản và có ít nhất 5 năm kinh nghiệm.
+ Chọn trâu cái nền: Tiến hành chọn lựa 150 trâu cái địa phương từ 5 đến 7 năm tuổi, sinh sản bình thường, đã đẻ được một lứa, sức khỏe tốt, khối lượng từ 300kg đến 400kg.
+ Theo dõi trâu cái động dục và phối giống: Theo dõi trâu cái động dục bằng các biện pháp thông thường là quan sát niêm dịch và niêm mạc âm đạo vào ban đêm, buổi sáng và những biểu hiện nhảy nhau, bỏ ăn, theo đực khác, âm hộ căng mòng, niêm dịch tiết nhiều, niêm mạc âm đạo xung huyết... Trâu cái động dục được phối giống TTNT với tinh đông lạnh dạng cọng rạ của các trâu Việt Nam.
+ Quản lý trâu thí nghiệm: Tất cả các trâu cái sinh sản được đánh số, có