METHANOL VÀ CAO PETROLEUM ETHER CỦA CÂY MÃ ĐỀ
IV.1 Xác định sự hiện diện của alcaloid[18]
Alcaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Trên thực tế có rất nhiều loài thực vật có alcaloid nhưng ở mức độ vết hoặc tỉ lệ phần vạn.
Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc tạo kết tủa với alcaloid, nhưng các thuốc thử này cũng có thể cho kết quả dương tính với các hợp chất như: coumarin, polyphenol, purin, amino acid... Ở đây, để xác định alcaloid chúng tôi thực hiện theo 2 quy trình sau:
Ngâm nguyên liệu (bột khô, cao PE, cao methanol) trong dung dịch H2SO4 3%. Đun nhẹ ở 80oC trong 6 giờ. Lọc lấy dung dịch để thử với các thuốc thử.
a. Thuốc thử Dragendorff
- Dung dịch 1: Hòa tan 8,0 gam nitrat bismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25 ml HNO3
30%.
- Dung dịch 2: Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N, trong 5 ml nước cất.
- Trộn hai dung dịch lại với nhau, theo cùng một tỉ lệ thể tích, ta được thuốc thử Dragendorff. Cho 2 ml mẫu thử vào hai ống nghiệm, rồi nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và quan sát hiện tượng, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện kết tủa từ vàng đến đỏ.
b. Thuốc thử Wagner
- Hòa tan 1,27 gam I2 và 2 gam KI trong 20 ml nước cất. Thêm nước cho đủ 100
ml ta được thuốc thử Wagner. Cho vài giọt thuốc thử này vào mẫu thử, nếu có alcaloid thì sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu.
Kết quả thí nghiệm
Thuốc thử Dragendorff Wagner
Bột khô - -
Cao PE - -
Cao methanol + +
- Hình ảnh thí nghiệm
Hình 5. Sự hiện diện của alcaloid trong cao methanol của cây mã đề
Nhận xét:
- Bột khô và cao PE của cây mã đề cho phản ứng âm tính với thuốc thử Dragendorff và thuốc thử Wagner.
- Cao methanol cho phản ứng dương tính với thuốc thử Dragendorff và thuốc thử Wagner. Vậy trong thành phần của cây mã đề có chứa alcaloid.
IV.2 Xác định sự hiện diện của flavonoid[18]
Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều loại rau, quả hoa... Phần lớn flavonoid có màu vàng; tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu, cũng được xếp vào nhóm này.
Để định tính flavonoid chúng tôi thực hiện theo hai quy trình sau:
a. Phản ứng với Cyanidin của Wilstatter hay con gọi là phản ứng Shibata
Đây là phản ứng khử bằng bột Mg trong HCl/ethanol trên các dẫn xuất flavonoid Cách thực hiện: Chuẩn bị hai ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml cao chiết đã được hòa tan hoàn toàn trong ethanol 95%. Ống 1 dùng làm đối chứng. Cho vào ống 2 thêm 1ml ancol tert-butil hoặc ancol isoamyl, 0,5 ml HCl đậm đặc, 3-5 hạt Mg. Đun nhẹ trong vài phút, sẽ xuất hiện màu ở lớp ancol phía trên.
Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung dịch trong ống 2 sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có chứa isoflavon, isolavanol, auron thì dung dịch sẽ không đổi màu.
b. Phản ứng với dung dịch chì acetate: dung dịch tạo kết tủa vàng nếu chứa flavonoid.
Kết quả thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thuốc thử Shibata Chì acetate
Cao PE - -
Cao methanol + +
- Hình ảnh thí nghiệm
Hình 6. Sự hiện diện của flavonoid trong cao methanol của cây mã đề Mẫu đối chứng Với Shibata Với chì acetate
Nhận xét:
- Cao PE phản ứng âm tính với thuốc thử Shibata, và phản ứng âm tính với dung dịch chì acetate.
- Cao methanol cho phản ứng dương tính với thuốc thử Shibata và phản ứng dương tính với dung dịch chì acetate.
- Vậy trong thành phần của cây mã đề có chứa flavonoid.
IV.3 Xác định sự hiện diện của steroid[18]
Steroid là nhóm hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực vật, với cấu trúc tổng quát là hệ thống vòng cyclopentannoperhydrophenantren hoặc một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên.
Để xác định sự hiện diện của steroid, chúng tôi thực hiện theo 2 phương pháp phổ biến sau đây:
a. Phản ứng với Liebermann-Burchard
- Cho vào ống nghiệm 1ml anhidrid acetic, 1ml chloroform. Làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho mẫu thử ở dạng rắn hoặc pha chloroform. Phản ứng dương tính là dung dịch đổi màu thành xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi.
b. Phản ứng với Salkowsky
- Hòa tan mẫu thử trong 1 ml chloroformvà nhỏ thêm vào khoảng 1 ml H2SO4
đậm đặc. Phản ứng dương tính là dung dịch đổi màu thành đỏ đậm, xanh, xanh-tím.
Kết quả thí nghiệm Thuốc thử Liebermann- Burchard Salkowsky Cao PE + + Cao methanol - - Mẫu khô + +
- Hình ảnh thí nghiệm
Hình 7.Sự hiện diện của steroid trong mẫu khô của cây mã đề
Nhận xét:
- Cao PE phản ứng dương tính với thuốc thử Liebermann- Burchard và phản ứng dương tính với thuốc thử Salkowsky.
- Cao methanol phản ứng âm tính với thuốc thử Liebermann- Burchard và phản ứng âm tính với thuốc thử Salkowsky.
- Mẫu khô phản ứng dương tính với thuốc thử Liebermann- Burchard và phản ứng dương tính với thuốc thử Salkowsky.
- Vậy trong thành phần của cây mã đề có chứa steroid.
IV.4 Xác định sự hiện diện của glycosid[18]
Các glycosid hiện diện rất nhiều trong họ thực vật và tất cả các bộ phận cây: lá, vỏ, hạt…Các glycosid thường kết tinh và có vị đắng.
Glycosid là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm 2 thành phần: phần đường và phần không đường thường gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzym thực vật hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thủy phân thành aglycon và đường.
Để xác định sự có mặt của glycosid, chúng tôi thực hiện theo 2 phương pháp sau:
a. Phản ứng với thuốc thử Tollens: Phản ứng của đường khử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị thuốc thử Tollens: Lấy khoảng 0,5 ml dung dịch AgNO3 10 % . Sau đó cho vào khoảng 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, thêm từng giọt NH4OH đến khi tan hết kết tủa.
Mẫu đối chứng Với Liebermann Burchard
- Cách thử: Trong một ống nghiệm chứa mẫu thử, thêm 5 giọt pyridin và 4 giọt thuốc thử Tollens. Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện gương bạc bám trên thành ống nghiệm hoặc có tủa màu trắng bạc của Ag kim loại.
b. Phản ứng với thuốc thử Fehling
- Thuốc thử Fehling được pha chế bằng cách trộn hai thể tích tương đương của hai dung dịch sau:
+ Dung dịch 1: Hòa tan 63,9 gam CuSO4.5H2O tinh khiết trong nước. Acid hóa dung dịch thu được bằng dung dịch H2SO4 loãng. Thêm nước cất đến 1 lit. Dung dịch thu được có màu xanh da trời.
+ Dung dịch 2: Hòa tan 346 gam tartrat kép kali natri (muối Seignette) và 120 gam NaOH trong nước sau đó thêm nước cất đến thể tích 1 lit. Dung dịch này không màu.
+ Trộn 2 dung dịch theo tỉ lệ 1:1 ngay trước khi sử dụng. Khi bảo quản lâu phải để riêng 2 dung dịch.
- Hòa tan mẫu thử vào thuốc thử Fehling và quan sát hiện tượng. Nếu thấy có kết tủa đỏ xuất hiện thì có sự có mặt của glycosid.
Kết quả thí nghiệm
Thuốc thử Tollens Fehling
Cao PE + +
Cao methanol + +
Hình ảnh thí nghiệm
Hình 8. Sự có mặt của glycosid trong cao methanol của cây mã đề.
Nhận xét:
- Cao PE và cao methanol đều phản ứng dương tính với thuốc thử Tollens và thuốc thử Fehling.
- Vậy trong thành phần của cây mã đề có chứa glycosid.
IV.5 Xác định sự hiện diện của saponin[18]
Tạo bọt là một đặc trưng của saponin, nên đây là một trong những phương pháp chính để xác định sự hiện diện của saponin.
a. Xác định sự hiện diện của saponin bằng cách tạo bọt
Cho 1g nguyên liệu vào trong bình cầu 250ml, thêm 100ml nước cất. Đun sôi 30 phút, lọc, để nguội, thêm nước cất cho đủ 100ml thu được dung dịch làm mẫu thử.
Thực hành: Lấy 10 ống nghiệm kích thước 16x16mm. Cho vào các ống nghiệm đánh số từ 1 đến 10 lần lượt 10ml dịch mẫu thử. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc ống nghiệm trong 15 giây (mỗi giây lắc 2 lần) rồi để yên 15 phút. Đo chiều cao các cột bọt để tìm xem ống nghiệm nào có cột bọt cao 1 cm. Thí dụ ống nghiệm số 4 có cột bọt cao 1 cm, chỉ số bọt của nguyên liệu khảo sát sẽ là:
Nếu cột bọt trong tất cả các ống nghiệm đều dưới 1 cm, chỉ số bọt dưới 100 nghĩa là không có saponin.
b. Thuốc thử Liebermann - Burchard
- Hòa tan cao chiết bằng chloroform.
Thực hành: Hòa tan mẫu bằng 1ml anhydric acetic, thêm từ từ 0,3 - 0,5ml H2SO4
thấy xuất hiện mặt phân cách giữa 2 dung dịch trong ống nghiệm:
Nếu có màu hồng đến đỏ hoặc tím thì nhận định sơ bộ có saponin triterpen. Nếu có màu xanh lá cây thì nhận định sơ bộ có saponin steroid. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10 x 1
Kết quả thí nghiệm
Thuốc thử Tạo bọt Liebermann - Burchard
Cao PE - -
Cao methanol + +
Hình ảnh thí nghiệm
Hình 9. Sự hiện diện của saponin trong cao
methanol của cây mã đề
Nhận xét:
- Cao PE không có sự tạo bọt và cho phản ứng âm tính với thuốc thử Liebermann – Burchard.
- Cao methanol có sự tạo bọt và cho phản ứng dương tính với thuốc thử Liebermann – Burchard.
- Vậy trong thành phần của cây mã đề có chứa saponin.
IV.6 Xác định sự hiện diện của tanin[18]
Tanin hiện diện với hàm lượng cao trong thực vật. Để xác định sự hiện diện của tanin ta có thể thực hiện bằng 2 cách:
- Hòa tan cao chiết bằng ethanol.
a. Thuốc thử Stiasny: Formol 36% 20ml, HCl đậm đặc 10ml.
Thực hành: Cho vào ống nghiệm 2ml mẫu thử, thêm 0,5ml thuốc thử Stiasny, đun nóng. Trầm hiện màu đỏ cho biết sự hiện diện của tanin.
b. Dung dịch chì acetate bão hòa:
Thực hành: Lấy 2ml mẫu thử cho vào ống nghiệm, thêm 4 giọt chì acetate . Trầm hiện màu vàng cho biết sự hiện diện của tanin.
Kết quả thí nghiệm
Thuốc thử Stiasny Chì acetate
Cao PE - -
Cao methanol + +
Hình ảnh thí nghiệm
Hình 10.Sự hiện diện của tanin trong cao methanol của cây mã đề
Nhận xét:
- Cao PE cho phản ứng âm tính với thuốc thử Stasny và chì acetate
- Cao methanol cho phản ứng dương tính với thuốc thử Stasny và chì acetate .
- Vậy trong thành phần của cây mã đề có chứa tanin. Mẫu đối chứng Thuốc thử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Stiasny
Thuốc thử chì acetate