1.3.2.1 Xác định số lượng tế bào
Phương pháp đơn giản nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính hiển vi. Dùng các phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại rẻ tiền nhất, lại có thể quan sát thấy kích cỡ và hình dáng tế bào.
Với tế bào vi khuẩn cần nhuộm màu hoặc là dùng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phase-constrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát hơn. Phòng đếm có cấu trúc để có một độ sâu nhất định lại có chia ra thành các ô nhỏ. Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính (lamelle/ cover glass) lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượng dưới kính hiển vi.
Khuyết điểm của phương pháp này là không xác định được với các mẫu có số lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không cao vì không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết[8].
Hình 17: Phòng đếm Petroff-Hauser: (a)- Mặt nhìn nghiêng của phòng đếm
(b)- Giữa phiến kính có phòng đếm với các ô nhỏ
(c) Ở độ phóng đại khoảng x 400-500 tiến hành đếm số lượng vi khuẩn trong các ô nhỏ.
1.3.2.2 Xác định khối lượng tế bào
Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tế bào mà còn ở cả sự tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định trọng lượng khô của tế bào. Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào. Sau đó rửa tế bào rồi làm khô trong lò sấy rồi cân trọng lượng khô. Phương pháp này thích hợp để xác định sự sinh trưởng của nấm. Phương pháp này tốn thời gian và không thật mẫn cảm. Đối với vi khuẩn vì trọng lượng từng cá thể là rất nhỏ, thậm chí phải ly tâm tới vài trăm ml mới đủ số lượng để xác định trọng lượng sinh khối khô.
Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hơn là dùng phương pháp đo mật độ quang (OD). Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Lúc nồng độ vi khuẩn đạt đến 107 tế bào/ml thì dịch nuôi cấy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cũng tăng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua dịch nuôi. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang phổ kế (spectrophotometer). Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, giữa nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính. Chỉ cần nồng độ vi sinh vật đạt tới nồng độ có thể đo được là đều có thể dùng phương pháp đo OD trên quang phổ kế để xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nếu hàm lượng một số vật chất trong mỗi tế bào là giống
nhau thì tổng lượng chất đó trong tế bào có tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật[8].
Hình18: Phương pháp đo OD
Chương 2: NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc
Trong nghiên cứu này, dung dịch nano bạc được cung cấp bởi Viện tiên tiến Khoa học và công nghệ (AIST) của Đại Học Bách Khoa Hà Nội. Dung dịch nano bạc được chế tạo bằng kỹ thuật khử hóa học sử dụng bức xạ UV kích thích với chất hoạt động bề mặt là axit oleic.
2.1.1 Quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hóa học với bức xạ UV kích thích. hóa học với bức xạ UV kích thích.
2.1.1.1 Hóa chất thí nghiệm sử dụng:
- AgNO3 (bạc nitrat): Độ sạch 99%, Trung Quốc.
- NaOH (natri hydroxyt): Hóa chất thí nghiệm, Trung Quốc. - NH4OH (amoni hydroxyt): Hóa chất thí nghiệm, Trung Quốc.
- C6H12O6 (đường glucozo): Hóa chất thí nghiệm.
- C17H33COOH (axit oleic): Hóa chất thí nghiệm và hóa chất công nghiệp
Axit oleic có công thức cấu tạo: CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH là chất không màu, không mùi, không vị, nóng chảy ở 140C. Khi thủy phân chất béo người ta thu được cả axit oleic cùng với các loại axit no và không no khác.
2.1.1.2 Thiết bị sử dụng
- Nước cất sạch.
- Các bình đựng hóa chất, ống đong, pipet. - Phim và giấy lọc.
- Máy khuấy từ và rung siêu âm để phân tán và làm đồng đều. - Đèn pin bức xạ UV, công suất 35W.
2.1.1.3 Quy trình tổng hợp
Hình 19: Sơ đồ quy trình điều chế hạt nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hoác học với bức xạ UV kích thích[1]
- Lấy 1.7 g bạc nitrat AgNO3 (dạng muối kết tinh màu trắng) hòa tan trong 100ml nước cất.
- Thêm vào dung dịch 0.62 g natri hydroxyt, NaOH, để tạo kết tủa Ag2O có màu đen.
- Hòa tan kết tủa bằng một lượng vừa đủ amoni hydroxyt, NH4OH, để tạo ra dung dịch phức bạc Ag(NH3)2OH trong suốt.
- Cho thêm một lượng chất hoạt động bề mặt axit oleic và khuấy đều trên máy khuấy từ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để tạo ra dung dịch đồng nhất và có độ nhớt cao.
- Sau đó thêm 2.0g đường glucozo và khuấy đều trên máy khuấy từ để thực hiện phản ứng khử. Trong quá trình khử sử dụng đèn bức xạ UV để kích thích phản ứng khử và điều khiển phân bố kích thước hạt nano bạc.
- Phản ứng khử được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 8 giờ.
2.1.2 Cơ chế hình thành hạt nano bạc
Quá trình hình thành hạt nano bạc được giải thích như sau:
- Đầu tiên, bức xạ UV kích thích các ion [Ag(NH3)2]+ hoạt động. Khi đó các phân tử đường glucose nhường điện tử cho Ag+ và tạo ra hạt nhân nguyên tử bạc Ag0
[Ag(NH3)2]+ + RCHOH hν Ag0 + 2NH3 + H+ + RCOH nAg0 (Agn)0
- Tiếp theo, các ion Ag+ ở trong dung dịch hấp phụ lên trên bề mặt nguyên tử bạc và tạo ra một lớp điện tích dương. Các điện tích dương Ag+ sẽ hút các ion RCOO- mang điện tích âm trái dấu và tạo ra lớp bảo vệ thứ nhất. Do nhóm carboxyl của ion oleate hướng về phía bề mặt của bạc nên đầu kị nước được hướng ra phía ngoài. Khi đó các ion oleate ở trong dung dịch tiếp tục gắn kết với lớp bảo vệ đầu và hình thành lớp bảo vệ thứ hai với đầu ưa nước hướng ra ngoài. Chính cấu trúc này khiến các hạt nano bạc phân tán đều trong nước và không bị kết đám[1].
Hình 20: Sự hình thành của 2 lớp ion oleate trên bề mặt hạt nano bạc
2.2 Ảnh hưởng của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn2.2.1 Phương pháp đo OD 2.2.1 Phương pháp đo OD
OD (Optical Density) – là phương pháp dùng để đo nồng độ tế bào có trong dung dịch huyền phù. Phương pháp này có ưu điểm lớn là có thể thực hiện trong thời gian ngắn và không gây phá hủy tế bào.
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên hiện tượng tán xạ ánh sáng: Khi truyền qua dung dịch huyền phù, ánh sáng sẽ bị tán xạ. Sự tán xạ phụ thuộc vào nồng độ tế bào trong dung dịch huyền phù. Nồng độ tế bào càng cao thì sự tán xạ càng lớn.
Thông thường, để xác định nồng độ tế bào, ta cần phải xác định mật độ quang (OD). Mật độ quang được xác định dựa vào tỷ số giữa cường độ ánh sáng trước khi qua mẫu và sau khi qua mẫu:
Trong đó:
- Aλ là mật độ quang tại bước sóng λ.
- I0 là cường độ sáng trước khi qua mẫu.
- I là cường độ sáng sau khi qua mẫu.
Người ta sử dụng bước sóng λ = 600 nm để xác định nồng độ tế bào theo công thức sau:
[Số tế bào/ml] = A600x(Hệ số chuyển đổi)x(Hệ số pha loãng)
Hệ số chuyển đổi được mặc định là 5x108. Không giống như phương pháp đo
2.2.2 Các trang thiết bị
- Máy quang phổ kế Beckman Coulter DU 730 (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)
Hình 21: Máy quang phổ kế Beckman Coulter DU 730
- Tủ nuôi cấy vi sinh vật (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)
- Bình tam giác, pipetman…
2.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường 2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường
- Lấy 12,5g bột LB (Luria-Bertani) pha với 0.5 ml nước cất, đun nóng cho bột tan hết.
- Rót dung dịch LB vào 10 bình tam giác, mỗi bình 30 ml. Các bình được chia thành 2 nhóm M1 và M2.
- Đem khử trùng các bình ở nhiệt độ 1800C.
2.2.3.2 Cấy vi khuẩn
- Đưa vào mỗi bình 1 ml dung dịch E. coli (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)
- Cho lần lượt vào mỗi bình 0 ml, 1.5 ml, 3.0 ml 4.5 ml, 6.0 ml và 7.5 ml dung dịch chưa hạt nano bạc 100 ppm (ppm = 1/1 000 000 = 10-4%) để được các dung dịch với nồng độ hạt nano bạc 0 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 25 µg/ml.
Hình 22: Các bình nuôi cấy
2.2.3.3 Đo OD
- Ủ các bình trong tủ lắc ở nhiệt độ 300C trong vòng 30 phút.
- Lấy 100 ml dung dịch ở mỗi bình đem đo OD ở bước sóng λ = 600 nm. - Lặp lại các bước trên 10 lần
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích dung dịch nano bạc
Hình 23: Dung dịch chứa hạt nano bạc ở các nồng độ khác nhau
Phân tích phổ UV-VIS của mẫu dung dịch có nồng độ 100ppm cho thấy sự xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 422nm. Điều này cho thấy sự có mặt của các hạt nano bạc trong dung dịch.
Hình24: Phổ UV-VIS của dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm
Kết quả phân tích từ ảnh TEM cho thấy các hạt nano trong dung dịch có hình cầu với kích thước trung bình khoảng 9-10 nm. Các hạt nano bạc phân tán đều, không bị kết đám cho thấy hiệu quả của việc sử dụng axit oleic làm chất hoạt động bề mặt.
Hình 25: Ảnh TEM của mẫu dung dịch nano bạc
3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt của dung dịch nano bạc
Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli bằng phương pháp đo OD, ta có bảng kết quả sau:
Bảng 3: Kết quả đo OD
KẾT QUẢ ĐO OD 0(μg/ml) 5(μg/ml) 10(μg/ml) 15(μg/ml) 25(μg/ml) M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 0.5 0.154 0.173 0.129 0.121 0.130 0.118 0.145 0.133 0.151 0.148 1.0 0.181 0.209 0.123 0.124 0.129 0.133 0.139 0.138 0.148 0.149 1.5 0.252 0.301 0.125 0.120 0.127 0.119 0.142 0.136 0.151 0.152 2.0 0.421 0.444 0.131 0.124 0.126 0.131 0.141 0.145 0.150 0.162 2.5 0.610 0.673 0.117 0.129 0.128 0.121 0.143 0.128 0.151 0.154 3.0 0.749 0.877 0.126 0.122 0.125 0.119 0.144 0.140 0.151 0.155 3.5 1.262 1.170 0.409 0.127 0.128 0.122 0.146 0.140 0.155 0.154 4.0 1.372 1.389 0.144 0.135 0.128 0.123 0.145 0.141 0.156 0.155 4.5 1.490 1.521 0.142 0.135 0.137 0.121 0.153 0.149 0.156 0.157 5.0 1.612 1.645 0.143 0.139 0.133 0.121 0.148 0.151 0.155 0.157 5.5 1.675 1.713 0.107 0.107 0.081 0.077 0.104 0.010 0.111 0.108 Ở hình 26, ta thấy đường cong sinh trưởng của mẫu có nồng độ hạt nano là 0(μg/ml) (không có mặt của các hạt nano bạc) có dạng tương tự như giai đoạn logarit trong lý thuyết. Ở giai đoạn này vi khuẩn phát triển rất nhanh do gặp môi trường nuôi thuận lợi, các tế bào phân chia đều đặn. Sau 11 giờ, mật độ vi khuẩn trong mẫu xấp xỉ là:
1.7x5x108 = 8.5x108 (tế bào/ml)
Hình 26: Đường cong sinh trưởng của E. coli khi không có mặt của nano bạc
Hình 27: Đường cong sinh trưởng của E. coli khi có sự xuất hiện của nao bạc a) Nồng độ 5(μg/ml) 31 a) t (giờ) OD t (giờ) OD
b) Nồng độ 10(μg/ml) c) Nồng độ 15(μg/ml) 32 b) c) t (giờ) t (giờ) OD OD
d) Nồng độ 25(μg/ml)
Hình 28: Đường cong sinh trưởng của E. coli trong tất cả các mẫu
Từ hình 27, tất cả các mẫu có nano bạc, pha lag kéo dài hơn bình thường, pha chỉ số hầu như không xuất hiện chứng tỏ vi khuẩn không thể phát triển được mặc dù được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng và đc ủ ở nhiệt độ thích hợp. Sau 10 giờ, quần thể vi khuẩn trong tất cả các mẫu này đều đạt tới giai doạn tử vong ngay cả khi quần thể vi
33 d) t (giờ) t (giờ) OD OD
khuẩn trong mẫu đối chứng chưa đạt tới pha cân bằng. Điều này chứng tỏ hiệu quả kháng khuẩn của nano bạc.
Nguyên nhân của các hiện tượng trên là do các hạt nano bạc liên kết với peptidoglican ở thành tế bào của vi khuẩn gây ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Và sau khi tác động lên màng tế bào vi khuẩn, các hạt nano bạc sẽ thâm nhập vào bên trong tế bào, tương tác với các enzym tham gia vào quá trình hô hấp dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của vi khuẩn.
Điều đáng chú ý là nồng độ tế bào trong tất cả các mẫu có chứa hạt nano bạc đều xấp xỉ nhau ở tất cả các mốc thời gian (mặc dù trong mẫu có nồng độ nano bạc cao hơn, nồng độ vi khuẩn sẽ thấp hơn). Sau 11 giờ, nồng độ vi khuẩn trong tất cả các mẫu có chứa hạt nano bạc đều xấp xỉ là:
0.1x5x108 = 0.5x108 (tế bào/ml)
Chứng tỏ nồng độ tế bào trong các mẫu có nano bạc nhỏ hơn 17 lần nồng độ tế bào trong mẫu không có nano bạc.
Từ kết quả trên ta thấy rằng với mọi nồng độ nano bạc từ 5 μg/ml đến 25 μg/ml đều thể hiện tính kháng khuẩn mạnh với E. coli.
Hình 29: Các bình nuôi sau 8 giờ: Ta thấy bình không có chứa hạt nano (ngoài cùng bên phải) bị vẩn đục chứng tỏ vi khuẩn phát triển mạnh. Các bình còn lại có chứa các hạt nano bạc
bình gần như không đổi mầu.
Trong 10 giờ đầu, mật độ vi khuẩn hầu như không đổi. Trong giai đoạn này vi khuẩn bị ức chế do tác dụng của các ion bạc được giải phóng từ hạt nano bạc. Tuy nhiên cấu trúc tế bào của vi khuẩn vẫn chưa bị phá hủy.
Sau 10 giờ, nồng độ vi khuẩn giảm mạnh cho thấy các tế bào đã bắt đầu bị phá hủy. Tuy nhiên trong bình nuôi cấy cũng có thể có các cá thể có khả năng kháng lại nano bạc tồn tại.
3.3 So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn
Trong phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn, ta tẩm dung dịch nano bạc vào một đĩa giấy ở nồng độ nhất định, rồi đặt đĩa có tẩm đó lên mặt môi trường thạch có cấy vi khuẩn thử nghiệm trước đó. Dung dịch nano bạc sẽ nhanh chóng khuếch tán trên môi trường thạch ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ[11]. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp ta biết được mức độ kháng khuẩn cuối cùng của dung dịch nano bạc (thể hiện qua bán kính vòng vô khuẩn)[11].
Phương pháp đo OD tuy có phức tạp hơn nhưng lại giúp ta biết được động thái phát triển của quần thể vi khuẩn dưới tác dụng của dung dịch nano bạc. Cụ thể hơn, ta có thể biết được ảnh hưởng của hạt nano bạc lên từng pha sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó xác định xem ở giai đoạn nào quần thể vi khuẩn dễ bị ảnh hưởng bởi hạt nano bạc nhất[2,9].
Chương 4: KẾT LUẬN
Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi đã:
1. Thử nghiệm chế tạo hạt nano bạc dạng dung dịch theo các nồng độ từ 5 µg/ml đến 25 µg/ml.
2. Nghiên cứu tác động của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn bằng kĩ thuật OD (trong 11 giờ).
3. Chứng minh được rằng các mẫu nano bạc dạng dung dịch đều thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh với vi khuẩn E. coli.
Định hướng, đề xuất cho các nghiên cứu tiếp theo:
1. Thử nghiệm tính kháng khuẩn của nano bạc với các chủng vi khuẩn gây bệnh khác.
2. Xác định nồng độ tối thiểu của hạt nano bạc để dung dịch có tác dụng kháng khuẩn
3. Nghiên cứu cơ chế tác động của hạt nano bạc lên vi khuẩn.