2.2.1 Phương pháp đo OD
OD (Optical Density) – là phương pháp dùng để đo nồng độ tế bào có trong dung dịch huyền phù. Phương pháp này có ưu điểm lớn là có thể thực hiện trong thời gian ngắn và không gây phá hủy tế bào.
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên hiện tượng tán xạ ánh sáng: Khi truyền qua dung dịch huyền phù, ánh sáng sẽ bị tán xạ. Sự tán xạ phụ thuộc vào nồng độ tế bào trong dung dịch huyền phù. Nồng độ tế bào càng cao thì sự tán xạ càng lớn.
Thông thường, để xác định nồng độ tế bào, ta cần phải xác định mật độ quang (OD). Mật độ quang được xác định dựa vào tỷ số giữa cường độ ánh sáng trước khi qua mẫu và sau khi qua mẫu:
Trong đó:
- Aλ là mật độ quang tại bước sóng λ.
- I0 là cường độ sáng trước khi qua mẫu.
- I là cường độ sáng sau khi qua mẫu.
Người ta sử dụng bước sóng λ = 600 nm để xác định nồng độ tế bào theo công thức sau:
[Số tế bào/ml] = A600x(Hệ số chuyển đổi)x(Hệ số pha loãng)
Hệ số chuyển đổi được mặc định là 5x108. Không giống như phương pháp đo
2.2.2 Các trang thiết bị
- Máy quang phổ kế Beckman Coulter DU 730 (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)
Hình 21: Máy quang phổ kế Beckman Coulter DU 730
- Tủ nuôi cấy vi sinh vật (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)
- Bình tam giác, pipetman…
2.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường 2.2.3.1 Chuẩn bị môi trường
- Lấy 12,5g bột LB (Luria-Bertani) pha với 0.5 ml nước cất, đun nóng cho bột tan hết.
- Rót dung dịch LB vào 10 bình tam giác, mỗi bình 30 ml. Các bình được chia thành 2 nhóm M1 và M2.
- Đem khử trùng các bình ở nhiệt độ 1800C.
2.2.3.2 Cấy vi khuẩn
- Đưa vào mỗi bình 1 ml dung dịch E. coli (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)
- Cho lần lượt vào mỗi bình 0 ml, 1.5 ml, 3.0 ml 4.5 ml, 6.0 ml và 7.5 ml dung dịch chưa hạt nano bạc 100 ppm (ppm = 1/1 000 000 = 10-4%) để được các dung dịch với nồng độ hạt nano bạc 0 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 25 µg/ml.
Hình 22: Các bình nuôi cấy
2.2.3.3 Đo OD
- Ủ các bình trong tủ lắc ở nhiệt độ 300C trong vòng 30 phút.
- Lấy 100 ml dung dịch ở mỗi bình đem đo OD ở bước sóng λ = 600 nm. - Lặp lại các bước trên 10 lần
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích dung dịch nano bạc
Hình 23: Dung dịch chứa hạt nano bạc ở các nồng độ khác nhau
Phân tích phổ UV-VIS của mẫu dung dịch có nồng độ 100ppm cho thấy sự xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 422nm. Điều này cho thấy sự có mặt của các hạt nano bạc trong dung dịch.
Hình24: Phổ UV-VIS của dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm
Kết quả phân tích từ ảnh TEM cho thấy các hạt nano trong dung dịch có hình cầu với kích thước trung bình khoảng 9-10 nm. Các hạt nano bạc phân tán đều, không bị kết đám cho thấy hiệu quả của việc sử dụng axit oleic làm chất hoạt động bề mặt.
Hình 25: Ảnh TEM của mẫu dung dịch nano bạc
3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt của dung dịch nano bạc
Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E. coli bằng phương pháp đo OD, ta có bảng kết quả sau:
Bảng 3: Kết quả đo OD
KẾT QUẢ ĐO OD 0(μg/ml) 5(μg/ml) 10(μg/ml) 15(μg/ml) 25(μg/ml) M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 0.5 0.154 0.173 0.129 0.121 0.130 0.118 0.145 0.133 0.151 0.148 1.0 0.181 0.209 0.123 0.124 0.129 0.133 0.139 0.138 0.148 0.149 1.5 0.252 0.301 0.125 0.120 0.127 0.119 0.142 0.136 0.151 0.152 2.0 0.421 0.444 0.131 0.124 0.126 0.131 0.141 0.145 0.150 0.162 2.5 0.610 0.673 0.117 0.129 0.128 0.121 0.143 0.128 0.151 0.154 3.0 0.749 0.877 0.126 0.122 0.125 0.119 0.144 0.140 0.151 0.155 3.5 1.262 1.170 0.409 0.127 0.128 0.122 0.146 0.140 0.155 0.154 4.0 1.372 1.389 0.144 0.135 0.128 0.123 0.145 0.141 0.156 0.155 4.5 1.490 1.521 0.142 0.135 0.137 0.121 0.153 0.149 0.156 0.157 5.0 1.612 1.645 0.143 0.139 0.133 0.121 0.148 0.151 0.155 0.157 5.5 1.675 1.713 0.107 0.107 0.081 0.077 0.104 0.010 0.111 0.108 Ở hình 26, ta thấy đường cong sinh trưởng của mẫu có nồng độ hạt nano là 0(μg/ml) (không có mặt của các hạt nano bạc) có dạng tương tự như giai đoạn logarit trong lý thuyết. Ở giai đoạn này vi khuẩn phát triển rất nhanh do gặp môi trường nuôi thuận lợi, các tế bào phân chia đều đặn. Sau 11 giờ, mật độ vi khuẩn trong mẫu xấp xỉ là:
1.7x5x108 = 8.5x108 (tế bào/ml)
Hình 26: Đường cong sinh trưởng của E. coli khi không có mặt của nano bạc
Hình 27: Đường cong sinh trưởng của E. coli khi có sự xuất hiện của nao bạc a) Nồng độ 5(μg/ml) 31 a) t (giờ) OD t (giờ) OD
b) Nồng độ 10(μg/ml) c) Nồng độ 15(μg/ml) 32 b) c) t (giờ) t (giờ) OD OD
d) Nồng độ 25(μg/ml)
Hình 28: Đường cong sinh trưởng của E. coli trong tất cả các mẫu
Từ hình 27, tất cả các mẫu có nano bạc, pha lag kéo dài hơn bình thường, pha chỉ số hầu như không xuất hiện chứng tỏ vi khuẩn không thể phát triển được mặc dù được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng và đc ủ ở nhiệt độ thích hợp. Sau 10 giờ, quần thể vi khuẩn trong tất cả các mẫu này đều đạt tới giai doạn tử vong ngay cả khi quần thể vi
33 d) t (giờ) t (giờ) OD OD
khuẩn trong mẫu đối chứng chưa đạt tới pha cân bằng. Điều này chứng tỏ hiệu quả kháng khuẩn của nano bạc.
Nguyên nhân của các hiện tượng trên là do các hạt nano bạc liên kết với peptidoglican ở thành tế bào của vi khuẩn gây ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Và sau khi tác động lên màng tế bào vi khuẩn, các hạt nano bạc sẽ thâm nhập vào bên trong tế bào, tương tác với các enzym tham gia vào quá trình hô hấp dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của vi khuẩn.
Điều đáng chú ý là nồng độ tế bào trong tất cả các mẫu có chứa hạt nano bạc đều xấp xỉ nhau ở tất cả các mốc thời gian (mặc dù trong mẫu có nồng độ nano bạc cao hơn, nồng độ vi khuẩn sẽ thấp hơn). Sau 11 giờ, nồng độ vi khuẩn trong tất cả các mẫu có chứa hạt nano bạc đều xấp xỉ là:
0.1x5x108 = 0.5x108 (tế bào/ml)
Chứng tỏ nồng độ tế bào trong các mẫu có nano bạc nhỏ hơn 17 lần nồng độ tế bào trong mẫu không có nano bạc.
Từ kết quả trên ta thấy rằng với mọi nồng độ nano bạc từ 5 μg/ml đến 25 μg/ml đều thể hiện tính kháng khuẩn mạnh với E. coli.
Hình 29: Các bình nuôi sau 8 giờ: Ta thấy bình không có chứa hạt nano (ngoài cùng bên phải) bị vẩn đục chứng tỏ vi khuẩn phát triển mạnh. Các bình còn lại có chứa các hạt nano bạc
bình gần như không đổi mầu.
Trong 10 giờ đầu, mật độ vi khuẩn hầu như không đổi. Trong giai đoạn này vi khuẩn bị ức chế do tác dụng của các ion bạc được giải phóng từ hạt nano bạc. Tuy nhiên cấu trúc tế bào của vi khuẩn vẫn chưa bị phá hủy.
Sau 10 giờ, nồng độ vi khuẩn giảm mạnh cho thấy các tế bào đã bắt đầu bị phá hủy. Tuy nhiên trong bình nuôi cấy cũng có thể có các cá thể có khả năng kháng lại nano bạc tồn tại.
3.3 So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn
Trong phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn, ta tẩm dung dịch nano bạc vào một đĩa giấy ở nồng độ nhất định, rồi đặt đĩa có tẩm đó lên mặt môi trường thạch có cấy vi khuẩn thử nghiệm trước đó. Dung dịch nano bạc sẽ nhanh chóng khuếch tán trên môi trường thạch ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ[11]. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp ta biết được mức độ kháng khuẩn cuối cùng của dung dịch nano bạc (thể hiện qua bán kính vòng vô khuẩn)[11].
Phương pháp đo OD tuy có phức tạp hơn nhưng lại giúp ta biết được động thái phát triển của quần thể vi khuẩn dưới tác dụng của dung dịch nano bạc. Cụ thể hơn, ta có thể biết được ảnh hưởng của hạt nano bạc lên từng pha sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó xác định xem ở giai đoạn nào quần thể vi khuẩn dễ bị ảnh hưởng bởi hạt nano bạc nhất[2,9].
Chương 4: KẾT LUẬN
Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi đã:
1. Thử nghiệm chế tạo hạt nano bạc dạng dung dịch theo các nồng độ từ 5 µg/ml đến 25 µg/ml.
2. Nghiên cứu tác động của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn bằng kĩ thuật OD (trong 11 giờ).
3. Chứng minh được rằng các mẫu nano bạc dạng dung dịch đều thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh với vi khuẩn E. coli.
Định hướng, đề xuất cho các nghiên cứu tiếp theo:
1. Thử nghiệm tính kháng khuẩn của nano bạc với các chủng vi khuẩn gây bệnh khác.
2. Xác định nồng độ tối thiểu của hạt nano bạc để dung dịch có tác dụng kháng khuẩn
3. Nghiên cứu cơ chế tác động của hạt nano bạc lên vi khuẩn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
[3] Công nghệ nano. Vi.wikipedia.org
http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%B4ng_ngh%E1%BB%87_nano
[4] Công nghệ nano và những ứng dụng trong thực tiễn, Trang 1
www.prt.vn/upload/Nghiencuu/ Congnghenano vaungdung.doc
[5] Giới thiệu về Kính hiển vi. Svtunhien.net, Trang 1
http://svtunhien.net/mybb/printthread.php?tid=693
[6] Nguyễn Hoàng Hải, Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Các hạt nano kim loại. Tạp chí
http://vatlyvietnam.org, 2007. Trang 9.
[8] Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Maxreading.com
http://maxreading.com/sach-hay/vi-sinh-vat/sinh-truong-va-phat-trien-cua-vi-sinh vat-37171.html
[13] Nguyễn Minh Trí, Một phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của Chitozan, Trang 1
[14] Nguyễn Ngọc Tú. Nghiên cứu gel nước thông minh nhạy pH lai nano bạc. Khóa luận tốt nghiệp đại học chính quy 2009. Trang 8-9.
Tiếng Anh
[1] Anh-Tuan Le*, P.T. Huy, Phuong Dinh Tam, Tran Quang Huy, Phung Dac Cam, A.A. Kudrinskiy, Yu A. Krutyakov, “Green synthesis of finely-dispersed highly bactericidal silver nanoparticles via modified Tollens technique”, Current Applied Physics, Vol. 10, pp. 910-916.
[2] Alesˇ Pana´ cˇek, Milan Kola´ rˇ, Renata Vecˇerˇova´, Robert Prucek, Jana Soukupova´, Vladimı´r Krysˇtof , Petr Hamal, Radek Zborˇil, Libor Kvı´tek, Antifungal activity of silver nanoparticles against Candida spp, Biomaterials 30 (2009), pp. 6333–6340.
[7] List of nanotechnology applications. en.wikipedia.org
http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_nanotechnology_applications
[9] Siddhartha Shrivastava, Tanmay Bera, Arnab Roy, Gajendra Singh, P Ramachandrarao and Debabrata Dash, Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles, Nanotechnology 18(2007) 225103, pp 9. [10] Silver. En.wikipedia.org
http://en.wikipedia.org/wiki/Silver
[11] Silver Nanoparticles: A Case Study in Cutting Edge Research. Cnx.org
http://cnx.org/content/m19597/latest/
[12] Preparation of Silver Nanoparticles and Their Characterization. Azonano.com
http://www.azonano.com/article.aspx?ArticleID=2318
[15] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3807907