3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong cây Ô đầu
3.2.1.1.Định tính các nhóm chất hữu cơ
Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Ô đầu
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Đánh giá Củ Thân Lá Hoa Hạt (1) (2) (3) (4) (5) (5) (7) (8) (9) 1 Alcaloid TT Mayer +++ ++ +++ +++ ++ Có TT Dragendorff +++ ++ +++ +++ ++ TT Bouchardat +++ ++ +++ +++ ++
2 Polysaccharid TT Lugol +++ - + - - có trong củ 3 Flavonoid Cyanidin - - ++ ++ - Có trong lá, hoa Kiềm - - +++ ++ ++ FeCl3 5% + + +++ +++ ++
4 Chất béo Để vết mờ trên gấy lọc +++ - - - ++ Có trong hạt, củ
5 Tinh dầu Có mùi thơm - - - Không có
6 Carotenoid H2SO4 đặc - ++ + + ++ Có trong thân, lá, hoa, hạt 7 Sterol Liebermann – Bourchardat ++ - ++ + - Có trong củ, lá, hoa 8 Coumarin Mở và đóng vòng lacton + - + + - Không có Diazo + - + + - Quan sát huỳnh quang - - - - -
49
10 Acid hữu cơ Na2CO3 khan ++ + ++ + + Có
11 Glycosid tim
TT Xanthydrol - - - - -
Không có
TT Legal - - - - -
12 Antranoid P/ư Bortraeger - - - Không có 13 Saponin Hiện tượng tạo
bọt - - - - - Không có
14 Đường tự do TT Fehling ++ + + + + Có
15 Acid amin TT Ninhydrin + + + + + Có
Ghi chú: - : Phản ứng âm tính
+ : Phản ứng dương tính ++ : Phản ứng dương tính rõ +++: Phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Qua kết quả ở bảng 3.1 cho thấy thành phần chính là alcaloid có trong củ, thân, hoa, lá, hạt; flavonoid có chủ yếu trong lá; polysaccharid có chủ yếu trong củ. Ngoài 3 thành phần hóa học chính này, cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang còn có acid béo, acid amin, đường tự do, sterol, carotenoid.
3.2.1.2. Định lượng một số nhóm chất hữu cơ
Định lƣợng alcaloid:
Hàm lượng alcaloid toàn phần và aconitin trong mẫu dược liệu, phân đoạn dịch chiết từ Phụ tử được trình bày ở bảng 3.2. (phương pháp định lượng trình bày ở phụ lục 3).
Bảng 3.2. Hàm lượng alcaloid trong Ô đầu, Phụ tử trồng ở Hà Giang
TT Mẫu định lƣợng Hàm lƣợng alcaloid tp (% kl/kl) Hàm lƣợng aconitin (% kl/kl) 1 Ô đầu sống (củ mẹ) 0.70 ± 0.04 0.125 ± 0.002 2 Phụ tử sống (củ con) 0.93 ± 0.06 0.072 ± 0.003 3 Phân đoạn D chiết từ Phụ tử 28.61 ± 0.75 0.066 ± 0.002 4 Phân đoạn E chiết từ Phụ tử 26.83 ± 0.68 0.015± 0.003
50
Nhận xét: Qua kết bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử cao hơn Ô đầu nhưng hàm lượng aconitin trong Phụ tử thấp hơn Ô đầu. Hàm lượng alcaloid toàn phần và aconitin trong PĐ D cao hơn PĐ E.
Định lƣợng flavonoid:
Hàm lượng flavonoid trong lá và phân đoạn chiết từ lá cây Ô đầu, xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis được trình bày ở bảng 3.3. (Phương pháp được xây dựng và thẩm định trình bày ở phụ lục 4).
Bảng 3.3. Hàm lượng flavonoid trong lá cây Ô đầu trồng ở Hà Giang
TT Mẫu định lƣợng Hàm lƣợng flavonoid (% kl/kl)
1 Lá cây Ô đầu 1.60 ± 0.02
2 Phân đoạn C chiết từ lá 38.24 ± 0.92 3 Phân đoạn E chiết từ lá 30.42 ± 0.79
Ghi chú: PĐ C, PĐ E được chiết xuất theo quy trình ở hình 3.17 mục 3.2.2
Nhận xét: Qua kết bảng 3.3 cho thấy, hàm lượng flavonoid toàn phần (tính theo quercetin) trong lá cây Ô đầu khá cao (1.6 %), trong PĐ C cao hơn PĐ E.
Định lƣợng polysaccahrid:
Hàm lượng polysaccharid trong Ô đầu, Phụ tử và phân đoạn chiết từ Phụ tử, xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis được trình bày ở bảng 3.4. (Phương pháp được xây dựng và thẩm định như Phụ lục 5).
Bảng 3.4. Hàm lượng polysaccharid trong Ô đầu, Phụ tử trổng ở Hà Giang
TT Mẫu định lƣợng Hàm lƣợng polysaccharid (% kl/kl)
1 Ô đầu sống (củ mẹ) 14.52 ± 0.48
2 Phụ tử sống (củ con) 19.63 ± 0.74
3 Phân đoạn I chiết từ Phụ tử 87.6 ± 0.84 4 Phân đoạn II chiết từ Phụ tử 72.8 ± 0.83
Ghi chú: PĐ I, PĐ II được chiết xuất theo quy trình ở hình 3.16 mục 3.2.2
Nhận xét: Qua kết bảng 3.4 cho thấy hàm lượng polysaccharid toàn phần (tính theo D-Glucose) trong Phụ tử cao hơn Ô đầu, trong PĐ I cao hơn PĐ II.
51
3.2.1.3. Định lượng các kim loại nặng
Hàm lượng các kim loại nặng so với dược liệu khô tuyệt đối, xác định bằng phương pháp khối phổ plasma cảm ứng, được trình bày ở bảng 3.5 và phụ lục 6.
Bảng 3.5. Hàm lượng các kim loại nặng trong Ô đầu, Phụ tử
STT Tên kim loại
nặng Hàm lƣợng kim loại nặng trong Ô đầu (mg/kg) Hàm lƣợng kim loại nặng trong Phụ tử (mg/kg) 1 Pb 0.359 0.980 2 Cr 6.939 10.063 3 Mn 22.370 67.208 4 Fe 8.423 31.736 5 Co 0.649 1.479 6 Ni 4.039 2.526 7 Cu 1.457 8.720 8 Zn 13.966 14.956 9 Cd 0.037 0.026 10 Hg 0.062 0.032 11 Ag 0.268 0.164 12 As 0.340 0.913
Nhận xét: Bằng kỹ thuật, thiết bị hiện đại đã xác định được hàm lượng của 12 kim loại nặng trong Ô đầu, Phụ tử sống. Đặc biệt hàm lượng của các kim loại nặng: As, Pb, Hg, Cd đều nằm trong giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn về kim loại nặng có trong thuốc, thực phẩm [7], [8].
3.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Ô đầu, Phụ tử
3.2.2.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Phụ tử [109]
Bột Phụ tử (2.8 kg) đã xay thô, sấy khô ở nhiệt độ 60 0C, ngâm chiết bằng ethanol (6 l x 3 lần x 24h/lần). Dịch chiết tổng được loại cặn bằng cách lọc qua giấy lọc, sau đó đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao ethanol (300.8 g). Cao ethanol được phân tán vào ít nước, kiềm hóa bằng amoniac đặc đến pH 9.0, lắc với n-hexan (3 lần x 750 ml/lần), gộp dịch chiết phân đoạn n-hexan và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao n-hexan (130.6 g). Cao n-hexan được phân tách bằng phương pháp sắc ký trên cột silica gel pha thường cỡ hạt 0.063-0.200 mm,
52
với hệ dung môi rửa giải là n-hexan - EtOAc có độ phân cực tăng dần (100:0, 80:20, 50:50, 35:65, 25:75, 15:85) thu được 6 phân đoạn lớn có kí hiệu từ A đến F.
- Phân đoạn A (3.2 g) tiến hành triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - aceton (90:10) thu được chất OD1 (29 mg) tinh thể màu trắng, Rf = 0.33 (n-hexan - aceton, 85:15).
- Phân đoạn B (2.1 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc (85:15) thu được chất OD2 (21 mg), OD3 (19 mg). Trong đó OD2 là tinh thể trắng đục, Rf = 0.30 (n-hexan - EtOAc, 85:15), OD3 là tinh thể màu trắng ngà, Rf = 0,40 (n-hexan - EtOAc, 85:15).
- Phân đoạn C (1.6 g), triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc - MeOH (85:15) thu được chất OD5 (16 mg), chất này hiện màu với thuốc thử Dragendorff, Rf = 0.4 (CH2Cl2 - MeOH = 85:15).
- Phân đoạn D (3.8 g), triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc - MeOH (80:20) thu được chất OP7 (17 mg), chất này hiện màu với thuốc thử Dragendorff, Rf = 0.20 (CH2Cl2 - MeOH = 95:5). Cũng từ phân đoạn D triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (90:10) thu được chất OD8 (16 mg), Rf = 0.52 (CH2Cl2 - MeOH = 95:5).
- Phân đoạn E (4.2 g) triển khai sắc ký cột trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063mm, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (90:10) thu được chất OD9 (16 mg), Rf = 0.45 (CH2Cl2 - MeOH = 95:5).
- Phân đoạn F (1.1 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3 - MeOH (90:10) thu được chất OD10 (15 mg), Rf = 0.35 (CHCl3 - MeOH = 95:5).
53
Hình 3.14. Sơ đồ chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Phụ tử
3.2.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Ô đầu [124]
Bột Ô đầu (củ mẹ) (3.2 kg) đã xay thô, sấy khô ở nhiệt độ 60 0C, được ngâm chiết bằng ethanol (6 l x 3 lần x 24 h/lần). Dịch chiết tổng được loại cặn bằng cách lọc
Phụ tử sấy khô (2.8 kg), xay thô (5-10 mm)
Ngâm chiết trong EtOH 96 % (6 l x 3 lần x 24 h/lần)
Dịch chiết ethanol
Cao ethanol (300.8 g)
Cao n-hexan (130.6 g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Chiết bằng n-hexan (3 lần x 750 ml/lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0.063-0.2 mm. Hệ dung môi: n-hexan và EtOAc (tỷ lệ EtOAc tăng từ 0-85 %)
PĐ A (3.2 g) PĐ E (4.2 g) PĐ C (1.6 g) PĐ B (2.1 g) PĐ D (3.8 g) PĐ F (1.1 g) OD1 29 mg SK cột silica gel OD5 16 mg OD2 21 mg OP7 17 mg OD3 19 mg OD8 16 mg OD9 20 mg OD10 15 mg SK cột silica gel
54
qua giấy lọc, đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao ethanol (298.9 g). Cao ethanol được phân tán trong ít nước, kiềm hóa bằng amoniac đặc đến pH 9.0, lắc phân đoạn với n-hexan (3 lần x 750 ml/lần), gộp dịch chiết phân đoạn n-hexan và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao n-hexan (129.5 g). Cao chiết n- hexan được phân tách bằng sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.063-0.200 mm, với hệ dung môi rửa giải là n-hexan - EtOAc có độ phân cực tăng dần (100:0, 80:20, 50:50, 35:65, 25:75, 15:85) thu được 6 phân đoạn lớn, kí hiệu từ G đến L. - Phân đoạn G (2.9 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - aceton (90:10) thu được 2 phân đoạn nhỏ OG và OH.
- Phân đoạn H (1.7 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.063- 0.200 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc (85:15), thu được PĐ OK. - Phân đoạn I (2.5 g), triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc(80:20) thu được chất OD4 (16 mg), Rf = 0.40 (CHCl3 - EtOAc, 85:15). Cũng từ phân đoạn I triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (90:10) thu được chất OD6 (18 mg), tinh thể có màu trắng đục, Rf = 0.50 (CH2Cl2 - MeOH, 90:10).
- Phân đoạn K (1.5 g), triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc - MeOH (80:20) thu được chất OD7 (12 mg), chất này hiện màu với thuốc thử Dragendorff, Rf = 0.20 (CH2Cl2 - MeOH = 95:5).
- Phân đoạn L (4.0 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (90:10) thu phân đoạn OL. - Phân đoạn M (2.3 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (90:10) thu được phân đoạn nhỏ OM.
55
Hình 3.15. Sơ đồ chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Ô đầu
3.2.2.3. Chiết xuất polysaccharid từ Phụ tử và Ô đầu [44], [46]
Quá trình chiết xuất polysaccharid từ Phụ tử như sau: 500 g bột Phụ tử được ngâm với 3 lít nước cất trong 1 h ở nhiệt độ 90 oC. Đem siêu âm 20 phút ở 90 o
C. Lọc lấy dịch chiết nước, loại bớt nước bằng cất quay chân không dưới áp suất giảm, nhiệt độ khoảng 90 oC, đến thể tích 300 ml và thêm ethanol 96 % đến tỷ lệ 80 % ethanol về thể tích, ly tâm 15000 vòng/phút, trong 20 phút, thu lấy tủa. Hòa tan tủa trong nước,
Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0.063-0.2 mm. Hệ dung môi là: n- hexan và EtOAc (tỷ lệ EtOAc tăng từ 0-85 %)
Ô đầu sấy khô (3.2 kg), xay thô (5-10 mm)
Ngâm chiết trong EtOH 96 % (6 l x 3 lần x 24 h/lần)
Dịch chiết ethanol
Cao ethanol (298.9 g)
Cao n-hexan (129.5 g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Chiết bằng n-hexan (750 ml x 3 lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
PĐ G (2.9 g) PĐ L (4.0 g) PĐ I (2.5 g) PĐ H (1.7 g) PĐ K (1.5 g) PĐ M (2.3 g) OG OD4 16 mg OD6 18 mg OH OD7 12 mg OK OL OM SK cột silica gel SK cột silica gel
56
tiến hành tủa polysaccharid lần nữa, thu lấy tủa, sấy khô ở 60 oC được 195.3 g polysaccharid toàn phần. Lấy 30 g bột polysaccharid thô hòa tan trong nước cất và triển khai sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G100, dung môi rửa giải là nước cất thu được phân đoạn chứa polysaccharid chính ký hiệu là: phân đoạn I (3.2 g) và phân đoạn II (2.0 g). Quá trình chiết xuất polysaccharid từ Ô đầu tương tự như Phụ tử. Sơ đồ chiết xuất polysacharid từ Phụ tử được trình bày ở hình 3.16.
Hình 3.16. Sơ đồ chiết xuất polysaccharid từ Phụ tử
Phụ tử sấy khô, xay nhỏ (1-3 mm)
Ngâm với 3 lít nước cất trong 1 h ở nhiệt độ 90 oC, siêu âm 20 phút
Dịch chiết nước
Tủa polysaccharid
Tủa polysaccharid bằng Ethanol 96 %, ly tâm lấy tủa
Dung dịch polysaccharid
Hòa tan tủa trong nước
Polysaccharid toàn phần
Tủa polysaccharid bằng Ethanol 96 %
Triển khai sắc ký trên cột Sephadex G100
57
3.2.3. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu [49], [57]
Lá Ô đầu (1.5 kg) sau khi thu hái được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60 0C, sau đó được ngâm chiết trong ethanol (4 lần x 5 l x 8 h/lần ). Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao ethanol (40 g).
Cao ethanol được kiềm hóa bằng dung dịch K2CO3 10 % (pH 8.0), lọc loại tạp thu được dịch nước, acid hóa bằng HCl 10 % (pH 6.0) và muối ăn NaCl bão hòa. Chiết lại bằng ethyl acetat (3 lần x 300 ml/lần) và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 15g cao ethyl acetat. Cao ethyl acetat triển khai sắc ký trên cột silica gel, cỡ hạt 0.063-0.200 mm, rửa giải bằng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan - EtOAc với nồng độ EtOAc tăng từ 0-100 %, EtOAc - MeOH với nồng độ MeOH tăng từ 0-80 %) thu được các phân đoạn có kí hiệu là: A, B, C, D, E.
Phân đoạn A (1.1 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc (1:3) thu được chất F1, tinh thể màu trắng, Rf = 0.57 (CHCl3 - EtOAc, 6:4). Chất này được kết tinh lại trong dung môi n-hexan.
Phân đoạn B (0.8 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063mm, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3 - EtOAc (90:10) thu được chất F2, tinh thể màu trắng, Rf = 0.30 (CH2Cl2 - EtOAc, 90:10). Chất này được kết tinh lại trong dung môi ethyl acetat.
Phân đoạn C (4.2 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc - MeOH (80:20) thu được chất F3 (16 mg), F4 (19 mg). Trong đó F3 là tinh thể vàng, Rf = 0.45 (CHCl3 - MeOH, 85:15); F4 là tinh thể màu vàng, Rf = 0.31 (CHCl3 - MeOH, 85:15). Các chất F3, F4 cho phản ứng hiện màu với dung dịch FeCl3 5 %.
Phân đoạn D (1.0 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc (85:15) thu được chất F7 (21 mg), tinh thể có màu trắng đục, Rf = 0.50 (CH2Cl2 - MeOH, 90:10).
Phân đoạn E (2.1 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha đảo YMC, cỡ hạt 0.030-0.050 mm, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH - EtOAc (90:10) thu được chất F5
58
(12 mg), F6 (22 mg). Chất F5 tinh thể màu vàng nhạt, Rf = 0.40 (CHCl3 - MeOH, 10:90). Chất F6 có màu vàng, Rf = 0.30 (CHCl3 - MeOH, 15:85).
Sơ đồ chiết xuất các hợp chất từ lá cây Ô đầu được trình bày ở hình 3.17
Hình 3.17. Sơ đồ chiết xuất và phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu
Lá Ô đầu sấy khô (1.5 kg), xay thô (5-10 mm)
Ngâm chiết EtOH 96 % (4 lần x 5 l x 8 h/lần) Dịch chiết ethanol
Cao ethanol (80 g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm