- Định tính các nhóm chất hữu cơ [1], [13], [20].
- Định lượng alcaloid toàn phần theo phương pháp acid-base [6], [127]:
Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (Ô đầu, Phụ tử) hoặc một lượng phân đoạn D, E tương đương khoảng 10 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 250 ml. Thêm 50 ml hỗn hợp ether-cloroform (3:1) và 4 ml dung dịch amoniac. Đậy nắp, lắc kỹ để qua đêm, gạn lọc thu dịch. Lắc bã với 50 ml hỗn hợp trên trong 1 giờ, lọc thu dịch lọc. Rửa bã 3-4 lần nữa, mỗi lần 15ml hỗn hợp trên. Gộp dịch lọc và dịch rửa, bốc hơi cách thủy đến khô ở nhiệt độ thấp (60-65 0C). Cắn hòa tan bằng 5ml ethanol, thêm chính xác 15ml H2SO4 0.02N và 15ml nước cất mới đun sôi để nguội, 3 giọt chỉ thi đỏ methyl. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.02N đến khi xuất hiện màu vàng.
1 ml dung dịch H2SO4 0.02N tương đương với 12,9mg alcaloid toàn phần tính theo aconitin
Hàm lượng phần trăm alcaloid toàn phần được tính theo công thức: X% =
Trong đó:
- X %: là hàm lượng alcaloid toàn phần (tính trên mẫu khô tuyệt đối) - p: là khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (g)
- n : số ml dung dịch NaOH 0.02N tham gia phản ứng (ml) - Định lượng aconitin bằng phương pháp HPLC [11], [13], [75], [127]
- Định lượng flavonoid toàn phần và polysaccharid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến [28], [33], [36], [34], [58], [96], [97].
35
- Xác định hàm lượng các kim loại nặng trong mẫu Ô đầu, Phụ tử bằng phương pháp đo phổ ICP-MS [26]:
Quy trình xử lý mẫu dược liệu (Bột Ô đầu, bột Phụ tử khô) để xác định hàm lượng kim loại nặng: Cân 10.0368 g bột Ô đầu (10.0683 g bột Phụ tử) cho vào chén thạch anh, thêm chất phụ gia (16 ml H
2SO
4 45 % và 4g KNO
3), trộn đều, sấy khô, đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 400-450 oC, sau đó ở 550 oC, đến khi hết than đen, được tro mẫu trắng. Hoà tan tro thu được trong 30ml dung dịch HCl 18 % và 2 ml HNO
3 65 %, đun nhẹ cho mẫu tan hết, đun nhẹ làm bay hơi acid đến còn muối ẩm, hòa tan muối này trong dung dịch acid HCl 2 %, cho vào bình định mức 10 ml và thêm dung dịch acid HCl 2% đến vạch, đo trên máy ICP-MS xác định hàm lượng các kim loại nặng.
- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột và theo dõi các phân đoạn bằng SKLM [1], [13], [14], [19], [44], [54, [68], [103] như sau:
+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60GF254
(Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol. + Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, 0.063-0.200 mm, Merck) và silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex G100
+ Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập dựa trên thông số vật lý và các phương pháp phổ gồm: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và 2 chiều [1], [13], [21], [30], [31], [32], [54], [72], [86], [101], [131].