Từ cơ sở lý thuyết trên, chúng tôi tiến hành thực hiện mục tiêu của đề tài bằng các phương tiện và phương pháp nghiên cứu như sau:
2.1. Phương tiện nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Nghiên Cứu Khoa Học, khoa Hóa học và Cơng nghệ thực phẩm, trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu.
Thời gian thực hiện 15 tuần.
2.1.1. Hóa chất sử dụng
Ethanol Phenolptalein
HCl KCl
CH3COOH CH3COONa
Axit citric Na2HPO4
NaOH NH3
Metyl đỏ Metyl da cam
.1.2. Dụng cụ - Thiết bị
Máy sấy Bể điều nhiệt
pH kế Máy quang phổ UV – Vis (Spectronic 200)
Tủ lạnh Hút chân không
Máy li tâm Thiết bị cô quay chân không
Cân phân tích Thiết bị đo độ ẩm
2.1.1.3. Nguyên liệu, chuẩn bị ngun liệu và quy trình trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím
a. Nguyên liệu và chuẩn bị nguyên liệu
Bắp cải tím được mua ở siêu thị Vũng Tàu, đem rửa sạch, thái nhỏ (<5mm), cân mỗi phần 20g, nghiền nhỏ.
b. Quy trình cơng nghệ chiết tách Anthocyanin từ bắp cải tím [11]
Trích ly Lọc Dịch trích Bảo quản, phân tích mẫu Xử lý
Ngâm trong dung mơi Ngun liệu
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết tách Anthocyanin từ bắp cải tím
Nguyên liệu sau khi được xử lý, tiến hành trích ly theo sơ đồ quy trình chiết tách ở hình 2.1. Với các nhân tố điều kiện trích ly ban đầu tại nhiệt độ 30oC, trong thời gian 60 phút, tỷ lệ nguyên liệu và dung mơi là 1:10. Mẫu sau khi trích ly được đem đi xác định hàm lượng chất màu và được bảo quản dùng cho tồn bộ q trình nghiên cứu.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: Cho 20g mẫu bắp cải tím và 200ml dung mơi vào bình tam giác 250ml có nắp đậy. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30oC bằng bể điều nhiệt, trong 60 phút. Sau đó đem đi lọc bằng thiết bị hút chân khơng. Dịch màu thu được đem đi ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, ta thu phần dịch màu
trong phía trên. Mẫu dịch chiết được bảo quản ở nhiệt độ 5oC trong bình sẫm màu có nắp đậy, dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
.2. Phương pháp và nội dung nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng và độ bền màu của Anthocyanin [9], [13]
− Xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai [6]
Dịch chiết sau khi trích ly được đem đi xác định hàm lượng bằng phương pháp pH vi sai.
Dựa trên nguyên tắc: Chất màu Anthocyanin thay đổi theo pH. Tại pH = 1 các Anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, cịn ở pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu.
Đo mật độ quang của mẫu tại pH = 1 và pH = 4,5 tại bước sóng hấp thụ cực đại λmax, so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm.
Dựa trên cơng thức của định luật Lambert-Beer
C l I Io . . lg =ε (1) Trong đó: I Io lg
: Đặc trưng cho mức độ ánh sáng yếu dần khi đi qua dung dịch hay còn gọi là mật độ quang, ký hiệu là A
I: Cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch I0: Cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch C: Nồng độ chất nghiên cứu, mol/l
l: Chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua ε: Hệ số hấp thụ phân tử, mol-1 cm-1
Xác định lượng Anthocyanin theo công thức:
g l V K M A a ; . . . . ε = (2) Trong đó:
A = (Aλmax.pH=1 – A700nm.pH=1) - (Aλmax.pH= 4,5 – A700nm.pH= 4,5)
Aλmax, A700nm: Độ hấp thụ tại bước sóng cực đại λmax và 700 nm, ở pH = 1 và pH = 4,5.
a: Lượng Anthocyanin, g
M: Khối lượng phân tử của Anthocyanin, g/mol l: Chiều dày cuvet, cm
K: Độ pha lỗng
V: Thể tích dịch chiết, l.
Từ đó tính được hàm lượng Anthocyanin theo phần trăm:
% Anthocyanin toàn phần = ( 100% 10 ). 100−w −2 m a (3) Trong đó:
a: Lượng Anthocyanin tính được theo công thức (2), g m: Khối lượng nguyên liệu ban đầu, g
w: Độ ẩm nguyên liệu, %.
− Phương pháp xác định độ bền màu của Anthocyanin [11]
Để nghiên cứu độ bền màu của Anthocyanin tách từ bắp cải, tiến hành đo độ hấp thụ tại bước sóng cực đại của mẫu trước và sau thử nghiệm. Độ bền màu được thể hiện bằng phần trăm độ bền màu cịn lại so với ban đầu, xác định theo cơng thức:
% Màu còn lại = 1
A
A .100%Trong đó: Trong đó:
A là độ hấp thụ của mẫu tại thời điểm đo xác định
A1 là độ hấp thụ của mẫu tại bước sóng cực đại ban đầu với mỗi mẫu nghiên cứu.
Để thực hiện mục tiêu của đồ án, chúng tơi tiến hành thí nghiệm khảo sát các nhân tố điều kiện tách chiết nhằm tăng khả năng trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím. Sau đó tiến hành nghiên cứu khả năng chỉ thị và ứng dụng của chất màu Anthocyanin từ bắp cải tím vào thực tiễn.
.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của hệ dung mơi đến khả năng trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím
a. Mục đích thí nghiệm
Khảo sát khả năng trích ly Anthocyanin của các hệ dung mơi khác nhau, từ đó tìm ra hệ dung mơi có khả năng trích ly tốt nhất.
Khảo sát các dung mơi:
− Nước
− Nước có bổ sung 1% HCl
− Hệ dung môi Ethanol – Nước tỷ lệ 1:1
− Hệ dung môi Ethanol – Nước tỷ lệ 1:1 có bổ sung 1% HCl
b. Chuẩn bị thí nghiệm
− Chuẩn bị mẫu bắp cải tím
− Chuẩn bị hệ dung mơi như trên
c. Tiến hành thí nghiêm
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như sơ đồ hình 2.1, với 1 nhân tố thay đổi là hệ dung môi và 3 lần lặp lại. Tổng số thí nghiệm là 12. Dịch màu sau khi trích ly được tiến hành đo quang phổ hấp thụ nhằm xác định nồng độ của dịch màu trong dịch chiết.
d. Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu Anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
2.2.1.3.Khảo sát sự ảnh hưởng tỷ lệ của dung mơi đến khả năng trích ly Anthocyanin
a. Mục đích thí nghiệm
Khảo sát khả năng trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím theo các tỷ lệ của dung mơi, từ kết quả khảo sát ở thí nghiệm mục 2.2.2. Để tìm ra tỷ lệ dung mơi có khả năng trích ly tốt nhất.
b. Chuẩn bị thí nghiệm
− Chuẩn bị mẫu bắp cải tím
− Chuẩn bị các dung mơi theo tỷ lệ
c. Tiến hành thí nghiêm
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như sơ đồ hình 2.1, với 1 nhân tố thay đổi là tỷ lệ dung môi và 5 lần lặp lại. Dịch màu sau khi trích ly được tiến hành đo quang phổ hấp thụ nhằm xác định nồng độ của dịch màu trong dịch chiết.
d. Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu Anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím
a. Mục đích thí nghiệm
Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím, từ đó tìm ra nhiệt độ cho khả năng trích ly cao nhất.
Khảo sát nhân tố nhiệt độ trích ly, với nhiệt độ tăng dần từ 30oC đến 70 oC (mỗi giá trị nhiệt độ khảo sát hơn kém nhau 5 oC).
b. Chuẩn bị thí nghiệm
− Thí nghiệm 3 được tiến hành dựa trên các điều kiện được chọn của thí nghiệm 1 và 2
− Các thí nghiệm được tiến hành trong bể điều nhiệt với các giá trị nhiệt độ tương ứng
c. Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như sơ đồ hình 2.1, thí nghiệm được tiến hành hồn tồn ngẫu nhiên với 1 nhân tố thay đổi là nhiệt độ. Tổng số thí nghiệm trong một lần là 9 thí nghiệm. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng nhiệt độ tương ứng. Tiến hành xác định nồng độ dịch chất màu sau khi chiết.
d. Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu Anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím
a. Mục đích thí nghiệm
Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím, từ đó tìm ra thời gian cho khả năng trích ly cao nhất.
Khảo sát nhân tố thời gian của q trình trích ly, với khoảng thời gian khảo sát từ 30 đến 120 phút (mỗi giá trị thời gian khảo sát hơn kém nhau 15 phút).
b. Chuẩn bị thí nghiệm
Thí nghiệm 4 được tiến hành dựa trên cơ sở các điều kiện được chọn của các thí nghiệm 1, 2 và 3.
c. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như sơ đồ hình 2.1, với 1 nhân tố thay đổi là thời gian trích ly. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng nhiệt độ tương ứng. Tổng số thí nghiệm là 21 thí nghiệm. Sau đó tiến hành xác định nồng độ dịch chất màu sau khi chiết.
d. Chỉ tiêu theo dõi
Hàm lượng chất màu Anthocyanin trong mỗi dịch chiết.
.2.6. Trích ly, cơ đặc và bảo quản mẫu dịch màu Anthocyanin chiết từ bắp cải tím
a. Mục đích thí nghiệm
Tiến hành trích ly mẫu Anthocyanin từ bắp cải tím với các điều kiện trích ly tốt nhất được khảo sát ở thí nghiệm 1, 2, 3 và 4. Cô đặc và xác định hàm lượng Anthocyanin trong dịch màu sau đó bảo quản làm mẫu cho tồn bộ q trình nghiên cứu.
b. Chuẩn bị thí nghiệm
− Chuẩn bị mẫu bắp cải tím
− Tiến hành thí nghiệm với các điều kiện tốt nhất đã khảo sát được
c. Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm trích ly Anthocyanin từ bắp cải tím được bố trí và tiến hành như sơ đồ hình 2.1, với các điều kiện trích ly đã chọn trên cơ sở các thí nghiệm 1, 2, 3 và 4. Sau khi trích ly, dịch chiết được đem đi cơ đặc trong thiết bị cô quay chân khơng ở nhiệt độ 50oC cho đến khi thể tích dịch cơ đặc cịn khoảng 2/5 thể tích ban đầu. Sau đó ta bổ sung Ethanol 96% vào dịch cơ đặc với một lượng bằng 20% thể tích dịch cơ. Ta tiến hành xác định hàm lượng % Anthocyanin. Mẫu dịch chiết cơ đặc được bảo quản tại nhiệt độ 5oC, trong bình sẫm màu có nắp đậy làm mẫu cho tồn bộ q trình nghiên cứu.
d. Chỉ tiêu theo dõi
− Bước sóng hấp thụ cực đại
− Hàm lượng chất màu Anthocyanin trong dịch cô đặc
.2.7. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến màu của Anthocyanin từ bắp cải tím
a. Mục đích thí nghiệm
− Khảo sát sự đổi màu của Anthocyanin trong các mơi trường pH khác nhau. Từ đó chứng minh được khả năng chỉ thị pH môi trường của Anthocyanin.
− Khảo sát sự đổi màu của Anthocyanin trong các môi trường pH (nhân tố D): pH = 1 ÷ 13 (D1 ÷ D13).
b. Chuẩn bị thí nghiệm
Mơi trường pH được tạo ra trong hệ đệm Citrate-photphat với dãy pH từ 1 đến 13 (với pH = 1 hiệu chỉnh bằng HCl 0,1N; với pH = 10 ÷ 13 hiệu chỉnh bằng NaOH 1N) [8].
c. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 1 nhân tố (D). Tổng số mỗi lần thí nghiệm là 13 thí nghiệm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng pH tương ứng.
Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.2.
Pha lỗng Dịch chiết Anthocyanin cơ đặc Dãy màu Quan sát bằng mắt Đo quang phổ hấp thụ D1 D2 D3 D13
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến màu của Anthocyanin