Áp dụng theo phương pháp mô bệnh học của D.V Lightner (1996)
Hình 2.4. Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học
• Cố định và bảo quản mẫu
Dùng dụng cụ giải phẫu cắt lấy một miếng nhỏ mô (khoảng 0,5cm3) từ cơ để cố định trong dung dịch: 100ml fomalin 10%, 900ml nước cất, 0,4g Acidsodiumphosphate monohydrate (NaH2PO4.H2O; 6,5g Anhydrous disodiumphosphate (Na2HPO4), tỷ lệ về thể tích giữa mẫu và dung dịch cố định là 1/10. Mẫu này được giữ trong dung dịch cố định từ 24 đến 48 giờ tùy thuộc vào khối mẫu lớn hay nhỏ mà thời gian cố định khác nhau. Sau thời gian cố định, mẫu được bảo quản trong cồn etanol 70%. Thời gian để bảo quản trong cồn etanol không giới hạn. Tuy vậy, mẫu càng
Đọc tiêu bản trên kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại
x100, x400 và x1000 Cố định và bảo quản mẫu
Thu mẫu
Đúc parafin Xử lý mẫu
Cắt lát mẫu
nhanh xử lý các bước tiếp theo càng tốt. Khi cố định và bảo quản cần ghi nhãn để tránh nhầm lẫn.
• Xử lý mẫu
Mẫu được lấy ra khỏi cồn 70% và được làm mất nước bằng cách ngâm trong dung dịch cồn etanol với liều lượng tăng dần (70%, 95% và 100%) trong 4 giờ cho mỗi nồng độ cồn. Sau đó tiếp tục ngâm mẫu trong dung dịch Methyl salicylate từ 12 đến 24 giờ để làm mềm mẫu, rồi thấm parafin vào mẫu bằng cách ngâm các mẫu này trong parafin nóng chảy (600C) với thời gian ít nhất là 6 giờ.
• Đúc mẫu trong Parafin
Lấy mẫu đã ngâm trong parafin, phân bố vào các khuôn, ghi nhãn để không bị nhầm lẫn, sau đó đổ parafin nóng chảy vào khuôn, dùng panh để sắp xếp mẫu vào chính giữa khuôn, chuyển vào dàn lạnh để khối mẫu nhanh chóng đông cứng thành khối parafin chứa mẫu ở trong.
• Cắt và sấy mẫu
Mẫu sau khi đúc parafin xong, được gọt thành khối hình thang cân hoặc hình chữ nhật. Sau đó, gắn lên máy Microtom và tiến hành cắt mẫu với độ dày lát cắt 3 đến 4 micromet. Lát cắt được đưa vào nước ấm 40 - 500C trong khoảng 1 - 2 phút có thể lâu hơn để mẫu giãn hết cỡ không bị nhăn, trong nước ấm có bổ sung lòng trắng trứng gà. Tiếp theo, dùng lam sạch lấy lát cắt ra khỏi nước và đặt lên máy sấy ở nhiệt độ 45 – 600C trong 1 – 4 giờ.
• Phương pháp nhuộm Hematoxyline và Eosin (H&E)
Nhằm để phát hiện những biến đổi trong tổ chức mô và tế bào khi nhiễm bệnh. Quy trình thực hiện nhuộm H&E như sau:
Làm mất parafin:
• Xilen I : 5 phút
• Xilen II: 5 phút
Làm no nước mẫu:
• Etanol 100% 2 – 3 phút
• Etanol 95% 2 – 3 phút
• Etanol 95% 2 – 3 phút
• Etanol 75% 2 – 3 phút
• Etanol 70% 2 – 3 phút
Rửa nước: nhúng trong nước từ 1 – 3 phút
Nhuộm Hematoxyline – Mayer từ 4 – 6 phút
Rửa qua nước chảy nhẹ từ 4 – 6 phút
Nhuộm Eosin 2 phút Làm mất nước mẫu: • Etanol 70% 2 – 3 phút • Etanol 75% 2 – 3 phút • Etanol 95% 2 – 3 phút • Etanol 95% 2 – 3 phút • Etanol 100% 2 – 3 phút • Etanol 100% 2 – 3 phút Làm trong mẫu: • Xilen I : 3 – 5 phút • Xilen II: 3 – 5 phút
Đậy lamel bằng Bomcanada
Đọc các tiêu bản nhuộm H &E dưới kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại: x100, x400 và x1000 để phát hiện các biến đổi trong tế bào và trong mô cá ở 7, 14, 21 sau khi tiêm nhũ dầu và vắc xin có nhũ dầu.