I. XÂY DỰNG CÁC YẾU TỐ TRONG QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM
4.3.Chọn lọc các yếu tố phân tích bằng LC-MS
4. Cách tiến hành
4.3.Chọn lọc các yếu tố phân tích bằng LC-MS
4.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính
a) Định nghĩa
Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích cho biết sự tỉ lệ giữa hàm lượng cần phân tích trong mẫu và đại lượng đo được trong vòng một khoảng đã cho. Trong đó, giữa đại lượng đo được và nồng độ phải thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính. Tính tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan R.
b) Dựng đường chuẩn
Hình 12. Đường chuẩn enrofloxacin
Trục X: nồng độ dung dịch chuẩn (ppb). Y: diện tích peak.
Bảng 4. Kết quả dựng đường chuẩn của ciprofloxacin
Nồng độ (ppb) 0 1,8 4,5 9,0 13,5 18 Diện tích peak (AA) 55 1003 2523 5219 7721 9720 Nồng độ (ppb) 0 1,8 4,5 9,0 13,5 18 Diện tích peak (AA) 19 1337 3619 7224 10621 14303
Hình 13. Đường chuẩn của ciprofloxacin
Hình 12, Hình 13 cho thấy các đường biểu diễn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát, với R2 tính được đều lớn hơn 0,99. Như vậy, quy trình định lượng có tính tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát.
4.3.2 Khảo sát độ lặp lại a) Qui trình xử lí mẫu a) Qui trình xử lí mẫu
Vortex
Li tâm 5 phút ( 4000rpm, 140C) Cân 2g mẫu cho vào ống nhựa 50ml +
10ml 1% HCOOH/acetonitril
Chiết lấy dịch ở lớp trên (acetonitrile), thổi khô bằng dòng khí N2
Hòa tan bằng 2ml MeOH/H2O 1:1
Thêm 2ml Hexan (loại béo)
Lắc 5 phút Li tâm 10 phút (6000rpm, 40 C) Đồng nhất mẫu LC-MS/MS Rút bỏ lớp trên
Lớp dưới cho qua siêu lọc 0,22m
Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Chuẩn bị mẫu trắng: là mẫu thủy sản (tôm, cá fillet) đã được phân tích Enrofloxacin, Ciprofloxacin nhiều lần (n = 6) và sắc ký đồ không có mũi Enrofloxacin, Ciprofloxacin. Mẫu tôm (cá fillet) được đồng nhất và cho vào túi nylon bảo quản ở nhiệt độ -20oC, dùng làm mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn.
Mẫu trắng: cân 2g, xử lí như qui trình trên.
Mẫu thêm chuẩn: mẫu trắng cân 1g tiêm 10ppb Enrofloxacin+Ciprofloxacin (thêm 0,1ml chuẩn 100ppb), vortex, để yên 30 phút, xử lí theo qui trình trên
Điều kiện sắc kí
Điều kiện của máy LC 6410B
Pha động A: HCOONH4/0,1% HCOOH Pha động B: Acetonitrile Chương trình gradient: Bảng 5. Chương trình gradient Thời gian (phút) %A %B 0 85% 15% 7.0 30% 70% 8.0 5% 95% 9.0 5% 95% 10.0 85% 15% 12.0 85% 15% - Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dòng: 0.4 ml/min - Thời gian kết thúc: 12 min - Thời gian nghỉ: 5 min - Điều kiện MS/MS
- Nguồn: ESI+
- Tốc độ dòng khí: 10 L/min
- Áp suất dòng khí N2 cho hệ phun sương: 40psi - Thế áp vào ống mao quản: 4000V, Positive
Điều kiện MS cho qui trình trên
Bảng 6. Điều kiện khối phổ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hợp chất Ion định lượng Ion định tính
Ciprofloxacin 332,2 288,2 332,2 245
Năng lượng phân mảnh
(V) 18 20
Hợp chất Ion định lượng Ion định tính
Enrofloxacin 360,2 316,2 360,2 342,2
Năng lượng phân mảnh
(V) 22 21
Công thức tính toán kết quả hàm lượng enrofloxacin, ciprofloxacin trong mẫu: Hàm lượng Enrofloxacin, Ciprofloxacin trong mẫu: =
m V X
(ppb)
X: nồng độ (ppb) có được từ diện tích peak mẫu với phương trình đường chuẩn. V: Thể tích pha loãng (ml).
m: Khối lượng mẫu ban đầu (g).
Bảng 7. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn Enrofloxacin
Nền Analytes Cspike(ppb) Độ lệch chuẩn r n=6 RSD(%) n=6 r=2.8*r Tôm M+C1 1,8 0,104 7,923 0,291 M+C2 3,6 0,105 3,842 0,294 M+C3 7,2 0,049 0,845 0,137 Cá M+C1 1,8 0,054 4,653 0,152 M+C2 3,6 0,155 6,116 0,434 M+C3 7,2 0,096 1,753 0,270
Bảng 8. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn Ciprofloxacin Nền Analytes Cspike(ppb) Độ lệch chuẩn r n=6 RSD(%) n=6 r=2.8*r Tôm M+C1 1,8 0,112 8,407 0,315 M+C2 3,6 0,072 2,745 0,202 M+C3 7,2 0,069 1,199 0,193 Cá M+C1 1,8 0,036 3,215 0,102 M+C2 3,6 0,061 2,786 0,171 M+C3 7,2 0,104 1,939 0,292
4.3.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng a) Giới hạn phát hiện (LOD) a) Giới hạn phát hiện (LOD)
- Định nghĩa: Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng).
- Cách tính toán
Giới hạn phát hiện của máy (LOD)
T C LOD3 Cmin
CCmin : Nồng độ dung dịch chuẩn chích vào máy ứng với 3 ≤ T ≤ 10
N S
TC : Tỷ lệ chiều cao tín hiệu chất cần phân tích trên nhiễu đường nền, ứng với
CCmin
Với phương pháp phân tích khi thực hiện đề tài này, thì kết quả tính toán được LOD=0,6ppb
b) Giới hạn định lượng (LOQ)
- Định nghĩa
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
- Cách tính toán (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
LOQ = 3LOD
Giới hạn phát hiện của phương pháp
T C LOQ3 Mmin
Với phương pháp này giới hạn định lượng tính toán được là LOQ=1,8ppb
4.3.4. Khảo sát độ đúng
Định nghĩa:
Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.
Thực hiện:
Độ đúng được tính toán trên tỷ lệ phần trăm thu hồi trong định lượng khi thêm vào một lượng chất tan đã cho biết vào mẫu đo.
Bảng 9. Kết quả khảo sát độ đúng đối với Enrofloxacin Nền Chất phân tích Cspike(ppb) Hiệu suất thu hồi (%)
Tôm M+C1 1,8 62,78-78,89 M+C2 3,6 72,50-80,56 M+C3 7,2 79,31-81,25 Cá M+C1 1,8 60,00-68,89 M+C2 3,6 65,83-76,39 M+C3 7,2 74,03-77,22
Bảng 10. Kết quả khảo sát độ đúng đối với Ciprofloxacin Nền Chất phân tích Cspike(ppb) Hiệu suất thu hồi (%)
Tôm M+C1 1,8 62,78-80,56 M+C2 3,6 84,33-90,33 M+C3 7,2 78,19-80,69 Cá M+C1 1,8 60,56-66,11 M+C2 3,2 70,33-76,00 M+C3 7,2 72,22-75,83
M+Cn:Mẫu trắng được tiêm vào dung dịch có nồng độ Cn
Nhận thấy: với nồng độ nhỏ hơn 10ppb, hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng từ 60%- 120% là phù hợp, vậy phương pháp có độ tin cậy.
4.3.5 Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp Bảng 11. Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp Bảng 11. Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp Nền Chất phân tích Hiệu suất
thu hồi (%) LOD
Tôm Enrofloxacin 62,7881,25 0,6ppb Ciprofloxacin 62,7890,33 0,6ppb Cá Enrofloxacin 60,0077,22 0,6ppb Ciprofloxacin 60,5676,00 0,6ppb
4.4. Thu mua mẫu
Bảng 12. Số liệu thu mua mẫu Tên chợ Cá tra phi lê và
nguyên con
Tôm thẻ và tôm
sú Ngày thu mẫu
Xuân Khánh (Q.Ninh Kiều) 3 3 16-1-2013 Hưng Lợi (Q.Ninh Kiều) 3 3 16-1-2013 An Nghiệp (Q.Ninh Kiều) 3 3 16-1-2013 An Lạc (Q.Ninh Kiều) 3 3 16-1-2013 Bình Thủy (Q.Bình Thủy) 3 3 16-1-2013 Phú Thứ (Q.Cái Răng) 3 3 16-1-2013 Tân An (Q.Ninh Kiều) 3 3 16-1-2013 Cái Răng (Q.Cái Răng) 3 3 16-1-2013
4.5. Tiến hành phân tích mẫu
II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Enrofloxacin
Bảng 13. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Enrofloxacin
TT Nền mẫu Số mẫu có dư lượng >MRL Số mẫu có dư lượng < MRL Số mẫu không phát hiện thấy dư lượng Tổng số mẫu 1 Tôm 0 2 22 24 2 Cá 2 4 18 24 Tổng 2 6 40 48 Tỷ lệ (%) 4,17 12,50 83,33 100
Bảng 14. Những mẫu bị phát hiện dư lượng enrofloxacin TT Kí hiệu mẫu Địa điểm lấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mẫu Dư lượng (ppb) MRL (ppb) Ghi chú 1 TOMXK3 Chợ Xuân Khánh
(Q.Ninh Kiều) 6,08 10 Tôm thẻ
2 CAAN2 Chợ An Nghiệp
(Q.Ninh Kiều) 3,13 10 Cá tra phi lê
3 CAAL1 Chợ An Lạc (Q.Ninh Kiều) 13,76 10 Cá tra nguyên con 4 CABT1 Chợ Bình Thủy (Q.Bình Thủy) 17,76 10 Cá tra nguyên con 5 CATA1 Chợ Tân An
(Q.Ninh Kiều) 1,28 10 Cá tra phi lê
6 CAPT2 Chợ Phú Thứ
(Q.Cái Răng) 5,07 10 Cá tra phi lê
7 TOMHL1 Hưng Lợi
(Q.Ninh Kiều) 7,27 10 Tôm sú
8 CACR3 Cái Răng
(Q.Cái Răng) 7,17 10
Cá tra nguyên con
Bảng 13, Bảng 14 cho thấy
- Có 8/48 mẫu bị nhiễm Enrofloxacin chiếm 16,67%, trong đó có 2 mẫu bị phát hiện dư lượng vượt quá mức tối đa cho phép (10ppb) chiếm 4,17%, và 6 mẫu bị phát hiện nhưng chưa vượt quá mức tối đa cho phép.
- Có 40 mẫu không phát hiện dư lượng Enrofloxacin chiếm 83,33% trong số 48 mẫu được phân tích.
2. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Ciprofloxacin
Bảng 15. Kết quả xác định dư lượng chất kháng sinh Ciprofloxacin
TT Nền mẫu Số mẫu có dư lượng >MRL
Số mẫu có dư lượng < MRL
Số mẫu không phát hiện thấy dư
lượng Tổng số mẫu 1 Tôm 0 0 24 24 2 Cá 0 3 21 24 Tổng 0 3 45 48 Tỷ lệ (%) 0 6,25 93,75 100
Bảng 16. Những mẫu bị phát hiện nhiễm Ciprofloxacin TT Kí hiệu mẫu Địa điểm lấy
mẫu Dư lượng (ppb) MRL (ppb) Ghi chú 1 CAAL1 Chợ An Lạc (Q.Ninh Kiều) 1,13 10 Cá tra nguyên con 2 CABT1 Chợ Bình Thủy (Q.Bình Thủy) 2,05 10 Cá tra nguyên con 3 CATA1 Chợ Tân An (Q.Ninh Kiều) 0,64 10 Cá tra nguyên con
Bảng 15, Bảng 16 cho thấy
- Có 3 mẫu phát hiện thấy có dư lượng Ciprofloxacin chiếm 6,25%, trong đó không có mẫu bị phát hiện dư lượng vượt quá mức tối đa cho phép (10ppb) và 2 mẫu bị phát hiện nhưng chưa vượt quá mức tối đa cho phép.
- Có 45 mẫu không phát hiện dư lượng Ciprofloxacin chiếm 93,75% trong số 48 mẫu được phân tích.
Nhận xét chung:
- Qua tiến hành phân tích 48 mẫu tôm, cá trên địa bàn thành phố cần thơ, phát hiện có 2 mẫu tôm nhiễm enrofloxacin, 5 mẫu cá nhiễm ciprofloxacin, trong đó có một mẫu cá nhiễm cả enrofloxacin và ciprofloxacin.
- Từ kết quả thu được cho thấy việc sử dụng chất kháng sinh họ Quinolones nói chung và Enrofloxacin, Ciprofloxacin nói riêng chưa được kiểm soát chặt chẽ. Mặc dù hàm lượng của các mẫu phát hiện dư lượng enrofloxacin, ciprofloxacin là tương đối thấp nhưng nếu ăn một lượng lớn và thường xuyên sẽ tích lũy lại trong cơ thể, lâu ngày sẽ làm giảm sự phát triển của sụn, gây viêm khớp, đau cơ, mất ngủ, mệt mỏi, thậm chí dẫn đến trầm cảm, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. KẾT LUẬN I. KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu, để tài đã đạt được mục tiêu đề ra
- Đã chọn lọc các yếu tố xác định enrofloxacin, ciprofloxacin trong tôm, cá bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)
+ Xác định được hiệu suất thu hồi từ 60%-90,33% nằm trong khoảng từ 60%- 120% (theo qui định của AOAC)
+ Xác định được giới hạn định lượng của phương pháp là 0,6ppb
- Với các yếu tố đã chọn lọc trên cơ sở phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ, đề tài đã tiến hành thu mua và phân tích 48 mẫu tôm, cá ở các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ đã thu được kết quả như sau:
Mẫu tôm: có 2/24 (8,3%) mẫu phát hiện dư lượng chất kháng sinh họ Quinolone có hàm lượng từ 6,08 – 7,27 ppb. Không có mẫu nào vượt quá mức cho phép của Bộ Y Tế.
Mẫu cá: có 6/24 (25%) mẫu phát hiện dư lượng chất kháng sinh họ Quinolone có hàm lượng từ 1,28- 17,76 ppb.Trong đó, có 2 mẫu vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y Tế (10ppb)
Từ kết quả thu được có thể kết luận:
Chất kháng sinh họ quinolone, đặc biệt là Enrofloxacin vẫn còn đang được sử dụng rộng rãi trong quá trình nuôi tôm, cá.
So với tôm (tôm thẻ và tôm sú), thì cá bị nhiễm nhiều hơn và nồng độ cao hơn, lượng cá tra nguyên con có dư lượng cao hơn mức cho phép. Tuy một số mẫu có dư lượng dưới mức cho phép nhưng nếu sử dụng lâu dài sẽ có những ảnh hưởng bất lợi đáng kể đến sức khỏe người tiêu dùng.
II. KIẾN NGHỊ:
Đối với các cơ quan chức năng: cần kiểm tra nghiêm ngặt hơn dư lượng kháng sinh họ quinolone trong thủy hải sản, đồng thời tổ chức các buổi tuyên truyền, hướng dẫn người dân về tác hại của việc sử dụng không đúng cách cũng như lạm
dụng các chất kháng sinh đến sức khỏe của con người và khả năng tiêu thụ sản phẩm.
Đối với các hộ nuôi trồng thủy sản: đừng vì lợi ích kinh tế mà lạm dụng các chất kháng sinh dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng.
Do thời gian không cho phép nên đề tài chỉ điều tra và phân tích với số lượng mẫu chưa lớn lắm. Trong thời gian tới, mong rằng đề tài được tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn và ở nhiều địa phương để góp phần làm chuẩn sản phẩm từ tôm, cá; nâng cao chất lượng cuộc sống cho mọi người, đồng thời góp phần làm cho ngành xuất khẩu thủy hải sản ở nước ta ngày càng phát triển hơn.
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc kí đồ dung dịch mẫu Blank
Phụ lục 12: Sắc kí đồ mẫu cá chợ An Lạc phát hiện Enrofloxacin 13,76ppb, Ciprofloxacin 1,31ppb
Phụ lục 13: Sắc kí đồ mẫu cá chợ Bình Thủy phát hiện Enrofloxacin 17,76ppb, Ciprofloxacin 2,05ppb
Phụ lục 17: Sắc kí đồ mẫu cá chợ Tân An phát hiện Enrofloxacin 1,28ppb; Ciprofloxacin 0,64ppb
Một số thiết bị dụng cụ dùng trong thí nghiệm
Máy li tâm lạnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn (2011), Quyết định số 2864/QĐ-BNN- QLCL, Qui định chỉ tiêu kiểm tra về chất lượng, an toàn thực phẩm đối với lô hang thủy sản xuất khẩu.
[2] Đinh Đăng Huy (2009), Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ Tandem LC- MS/MS, luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội.
[3] Nguyễn Thị Thanh Nga (2009), Nghiên cứu qui trình xác định dư lượng Ciprofloxacin, Enrofloxacin trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC-MS/MS, luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
[4] Nguyễn Thị Thu Thủy (2009), Nghiên cứu xác định Ciprofloxacin (CIP) trong một số dược phẩm bằng phương pháp điện hóa, luận văn thạc sĩ, Đại học Hà Nội.
[5] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc qia TP Hồ Chí Minh.
[6] Tạp chí Khoa học và Phát Triển (2008), tập VI,số 3: 261, Ứng dụng phương pháp Elisa để phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[7] Viện Kiểm Nghiệm Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm Quốc Gia (2010), Thẩm Định phương pháp trong phân tích Hóa học và Vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật. [8] Determination of Fluoroquinolones in Bovine, Porcine and Avian Tissues by Liquid Chromatography with Flourescence Detection, FQL-SP04, Canadian Food Inspection Agency, Saskatoon, Saskatchenwan, Canada, 2001
[9] Manual of Methods of Analysis of Food (2012), Antibiotics and Hormone Residues, Food Safety and Standards Authority of India Ministry of Health and Family Welfare Government of India, New Delhi.
[10] Joan Steven, and Limian Zhao, Agilent Technologies, 2010 AOAC International, Determination of Quinolone Antibiotics in Bovine Liver using QuEChERS Extraction with Analysis by LC/MS/MS , 2850 Centerville Road, Wilmington, DE 19808.
[11] http://en.wikipedia.org/wiki/Antibiotic [12] http://en.wikipedia.org/wiki/Quinolones
[13] http://d.violet.vn/uploads/resources/562/2278115/preview.swf
[14]http://www.lrchueuni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/phanloai/Nhom%20Q/QUI NOLONES.htm&key=&char=phanloai