V. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HỌ QUINOLONE[3],[4],[6],[8],[10]
2. Phương pháp Elisa
2.1. Giới thiệu chung
Đây là một phương pháp xét nghiệm để phát hiện chất kháng sinh enrofloxacin của nhóm quinolone. Phương pháp này thích hợp dùng để định tính hoặc định lượng những mẫu bị nhiễm enrofloxacin như nước, cá, động vật có vỏ.
2.2. Nguyên liệu:
Mẫu trắng: là mẫu tôm không chứa nhóm kháng sinh quinolone đã được khẳng định bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS) tại phòng thí nghiệm phân tích thực phẩm - Bộ môn khoa học thực phẩm – Khoa Thú y – Đại học Liege, Vương quốc Bỉ.
Dung dịch kháng sinh chuẩn:
Kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones được sử dụng gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, ciprofloxacin và sarafloxacin ở dạng bột đều là sản phẩm của Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).
Dung dịch gốc 1mg/ml: hòa tan trong methanol có NH4OH 2M. Dung dịch dung củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1mg/ml) bằng nước cất. Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9g NaCl, 7,78g Na2HPO4.2H2O và 0,75g KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất).
Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl; 7,78 gam Na2HPO4.2H2O và 0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất).
Kit Elisa phân tích quinolone: 10 bộ kit thuộc 5 lô khác nhau do phòng thí nghiệm Hormonologie – CER, Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp.
2.3. Hướng dẫn an toàn
Dung dịch chuẩn trong bộ kit này chứa một lượng nhỏ enrofloxacin, dung dịch nền được thêm vào tetramethylbenzidine và axit sunfuric loãng. Vì thế, cần tránh tiếp xúc, nếu bị dính vào da hay mắt phải rữa kĩ với nước.
2.4. Bảo quản và lưu trữ
Bộ kit Elisa nên được bảo quản trong tủ lạnh ở 4-80C. Trước khi sử dụng, phải mang ra ngoài để chúng đạt tới nhiệt độ phòng (20-250C). Thuốc thử có thể được sử dụng đến ngày hết hạn in trên hộp.
2.5. Nguyên tắc thử
Phương pháp Elisa trực tiếp dựa trên sự nhận ra enrofloxacin bởi một kháng thể đặc hiệu. Enrofloxacin khi hiện diện trong mẫu và enzyme enrofloxacin (gồm hapten và Enzyme) sẽ cạnh tranh trực tiếp với nhau để kết hợp với kháng thể đặc hiệu đã được phủ lên các giếng nhỏ. Sau đó rửa và thêm dung dịch chất nền, một tín hiệu màu sẽ xuất hiện, cường độ của tín hiệu màu xanh sẽ tỉ lệ nghịch với nồng độ của enrofloxacin hiện diện trong mẫu. Phản ứng màu dừng lại sau một thời gian qui định và màu sẽ được đánh giá bởi một quang kế. Nồng độ của mẫu được xác định bằng phương pháp nội suy, sử dụng đường chuẩn đã xây dựng trong mỗi lần chạy.
Ưu điểm: Có thể nhận biết được nhiều chất hữu cơ và vô cơ, thao tác nhanh và đơn
giản, có thể làm với khối lượng mẫu lớn, mẫu không cần làm tinh sạch như phương pháp sắc kí, phương pháp có khả năng phát hiện các quinolones trong tôm với độ đặc hiệu 100%. Hay nói cách khác nếu mẫu thực sự âm tính thì 100% kết quả phân tích sẽ là âm tính
Nhược điểm: độ tin cậy không cao (có thể gặp trường hợp dương tính giả) do có thể
có những sai sót trong quá trình xử lí mẫu, điều kiện bảo quản không được đảm bảo.
2.6. Kết quả
Trong tổng số 90 mẫu phân tích, 9 mẫu tôm bị nhiễm quinolone (tỷ lệ nhiễm 10%). Đặc biệt, tất cả các địa phương nghiên cứu đều phát hiện mẫu bị nhiễm quinolone với nồng độ dư lượng cao nhất là 145 ppb và thấp nhất là 0,4 ppb. Điều đáng quan tâm là tất cả các mẫu có nồng độ dư lượng lớn hơn hoặc bằng 0,7 ppb đều phát hiện được bằng phương pháp ELISA. Riêng mẫu được phát hiện nhiễm enrofloxacin ở nồng độ 0,4 ppb bằng phương pháp LC-MS/MS thì phương pháp ELISA không phát hiện được. Kết quả này hoàn toàn phù hợp vì nồng độ nhiễm bé hơn ngưỡng phát hiện của phương pháp (0,7ppb).