3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Lập phiếu ựiều tra ựể chủ ựộng thu thập thông tin liên quan ựến các nội dung nghiên cứu dịch tễ học (Nguyễn Như Thanh và cs, 2011)
2.3.2. Phương pháp xác ựịnh sự có mặt của virus Newcastle trong bệnh phẩm (não gà) nghi bệnh
- Bước 1: Gây nhiễm huyễn dịch não của gà trong ựàn nghi bệnh vào xoang niệu của phôi gà 10-12 ngày ựang phát triển
Lấy não của gà trong ựàn xảy ra bệnh Newcastle nghiền và pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10. Khử tạp khuẩn bằng kháng sinh rồi tiêm vào phôi thai gà 10 Ờ 12 ngày, tiêm 0,2 ml cho mỗi phôi vào xoang niệu, ấp tiếp ở 370C 2- 4 ngày. Hàng ngày soi trứng ựể phát hiện phôi chết và ghi lại thời gian gây chết phôi. Những phôi gà chết, lấy ra ựể ở tủ lạnh 0- 40C/6h cho mạch máu co lại và nước trứng trong. Sau ựó mổ trứng thu nước trứng và kiểm tra bệnh tắch trên phôi. Thử vô trùng nước trứng bằng cách cấy vào các môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu. Bảo quản nước trứng trong tủ lạnh âm.
- Bước 2: Tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Haemagglutintion Test) xác ựịnh sự có mặt của virus Newcastle trong nước
trứng sau khi gây nhiễm huyễn dịch não của gà trong ựàn nghi bệnh (Nguyễn
Bá Hiên và cs, 2010). - Nguyên liệu: + Hồng cầu gà 1%
+ Nước trứng có chứa virus sau khi gây nhiễm huyễn dịch não của gà trong ựàn xảy ra bệnh (đã chuẩn bị ở bước 1)
+ Nước sinh lý vô trùng.
+ Các máy móc (tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnhẦ), dụng cụ (ựèn soi trứng, giá mổ trứng, bộ ựồ mổ trứng, hộp lồng, ống hút, ống nghiệm, giá ống nghiệm, panh, kẹp Ầ), hóa chất (Xitrat natri, cồn-Iod).
* Chuẩn bị:
- Hồng cầu gà 1%:
Lấy 10ml máu tim của gà khỏe mạnh +5ml xitrat natri 5% ựể chống ựông. Ly tâm 3000 vòng/ phút, trong vòng 10 phút. Hút nước trong ở phắa trên bỏ ựi, thu lấy hồng cầu. Cho nước sinh lý vào rửa hồng cầu, ly tâm rồi hút bỏ phần nước trong ở trên (làm như vậy 3 lần). Cuối cùng ựược hồng cầu ựặc.
Lấy hồng cầu ựặc pha với nước sinh lý thành hỗn dịch 1%. * Tiến hành phản ứng:
Phản ứng ựược tiến hành trên tấm nhựa ngưng kết (Microplates) có 96 lỗ ựáy chữ U hoặc ựáy chữ V.
Cho các thành phần vào dãy phản ứng theo sơ ựồ sau:
- Dùng micropipet nhỏ vào các giếng, từ giếng thứ nhất ựến giếng thứ 10, mỗi giếng 50ộl nước sinh lý. Sau ựó cho vào giếng thứ nhất 50ộl nước trứng chứa virus, trộn ựều rồi hút sang giếng thứ hai 50ộl. Trộn ựều rồi hút từ giếng thứ 2 sang giếng thứ ba 50ộl. Tiếp tục làm như vậy cho ựến giếng thứ 10, trộn ựều rồi hút bỏ ựi 50ộl.
Như vậy ựộ pha loãng nước trứng (Hiệu giá virus) thứ tự từ giếng 1 ựến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8, 1/16, 1/32. 1/64Ầ1/1024.
- Nhỏ hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng, mỗi giếng 50ộl.
- Lắc ựều tấm nhựa ngưng kết, ựể ở nhiệt ựộ phòng, sau 20 phút ựọc kết quả. * Kết quả:
- Phản ứng dương tắnh: Hồng cầu ngưng kết thành những hạt lấm tấm nằm rải ựều trên bề mặt ựáy giếng như hình cái dù lộn ngược, giống như ở giếng ựối chứng dương. Hiệu giá ựọc ở giếng ngưng kết cuối cùng (trước ống không ngưng kết). Thắ dụ ngưng kết ở giếng thứ 6 thì hiệu giá ngưng kết là 1/64.
- Phản ứng âm tắnh: Hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ, nước ở trên trong, giống như ở giếng ựối chứng âm.
Sơ ựồ tiến hành phản ứng HA đối chứng Ô giếng số Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (-) (+) Nước sinh lý (ộl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Nước trứng chứa virus (ộl) 50 50
Hiệu giá virus 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
Hồng cầu gà 1% (ộl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
2.3.3. Phương pháp xác ựịnh hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh của gà ở ựàn xảy ra bệnh
Tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà HI - Haemagglutination Inhibition Test (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2010) ựể kiểm tra hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh của gà ở ựàn xảy ra bệnh.
* Chuẩn bị
- Hồng cầu gà 1% (chế như trong phản ứng HA)
- Huyết thanh của gà trong ựàn ựang xảy ra bệnh Newcastle: Bắt ngẫu nhiên một số gà trong ựàn ựang xảy ra bệnh Newcastle, lấy máu chắt huyết thanh riêng từng con ựể kiểm tra hiệu giá kháng thể. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Kháng nguyên chuẩn: Virus Newcastle ựã biết (Virus vacxin chủng Mukteswar) ựược xác ựịnh bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà và ựược pha ở hiệu giá chứa 4 ựơn vị ngưng kết hồng cầu (4 ựơn vị HA) ựể chắc chắn có ngưng kết khi làm phản ứng. Thắ dụ virus vacxin chủng Mukteswar khi làm phản ứng ngưng kết hồng cầu, có hiệu gắa ngưng kết là 1/256 (1 ựơn vị HA) thì ở phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu này virus vacxin pha ở hiệu giá 1/64. Cách tắnh cụ thể: 1 ựơn vị HA là 1/156 thì 4 ựơn vị HA là 1/256 x 4 = 4/256 hay 1/64
* Tiến hành phản ứng:
Phản ứng ựược tiến hành trên tấm nhựa ngưng kết (Microplates) có 96 giếng ựáy chữ U hoặc ựáy chữ V.
Sơ ựồ tiến hành phản ứng HI đối chứng Ô giếng số Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 (+) (-) Nước sinh lý (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 50
Huyết thanh gà cần kiểm tra (ộl) 25
độ pha loãng HT 1/2 Ử 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
Virus Newcastle chuẩn (4 ựơn vị HA) (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 50
Hồng cầu gà 1% (ộl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Lắc ựều, ựể yên 30 phút
Dùng micropipet nhỏ vào các giếng, từ giếng thứ nhất ựến giếng thứ 8, mỗi giếng 25ộl nước sinh lý. Sau ựó cho vào giếng thứ nhất 25ộl huyết thanh của gà cần kiểm tra hiệu giá kháng thể. Trộn ựều rồi hút 25ộl từ giếng thứ nhất sang giếng thứ hai. Trộn ựều rồi hút 25ộl từ giếng thứ 2 sang giếng thứ 3. Tiếp tục làm như vậy ựến giếng thứ 8, trộn ựều rồi hút bỏ ựi 25ộl. Như vậy huyết thanh của gà cần kiểm tra ựược pha loãng theo bậc 2 lần lượt từ giếng thứ nhất ựến giếng thứ 8 là : 1/2, 1/4 , 1/8, 1/16, 1/32. 1/64. 1/128, 1/256.
- Cho 25ộl dịch virus Newcastle chuẩn có hiệu giá 4HA vào tất cả các giếng từ giếng 1 ựến giếng 8
- Lắc ựều tấm nhựa ngưng kết, sau ựó ựể ở nhiệt ựộ phòng 30 phút cho kháng thể tác ựộng ựến kháng nguyên
- Cho 25ộl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng.
-Lắc ựều tấm nhựa ngưng kết, ựể ở nhiệt ựộ phòng 30 phút rồi ựọc kết quả. *Kết quả:
Nếu trong huyết thanh của gà có chứa kháng thể Newcastle thì kháng thể này sẽ trung hòa virus Newcastle chuẩn, do ựó không còn virus ựể làm ngưng kết hồng cầu gà.
Căn cứ vào hiện tượng ngưng kết hồng cầu của phản ứng, có thể xác ựịnh ựược hàm lượng kháng thể Newcastle có trong huyết thanh của gà. Hàm lượng kháng thể càng cao thì khả năng trung hòa virus càng lớn và ngược lại. Hiệu giá kháng thể trong phản ứng ngăn trở ngưng kết là ựộ pha loãng lớn nhất của huyết thanh có thể ngăn cản hoàn toàn sự ngưng kết hồng cầu của virus Newcastle. Thắ dụ hiện tượng gây ngưng kết chỉ bắt ựầu nhận thấy ở giếng thứ 6 thì hiệu giá kháng thể là 1/64.