Dây rốn dài khoảng 40 tới 60 cm, đảm bảo quá trình trao đổi chất giữa thai nhi và cơ thể mẹ. Nghiên cứu phôi thai học và HLA cho thấy các tế bào của dây rốn có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ ngƣời mẹ [1],[57],[119].
Máu dây rốn đã đƣợc nghiên cứu và phát hiện thấy có nhiều TBG tạo máu tƣơng tự nhƣ ở tuỷ xƣơng. Máu dây rốn đã đƣợc sử dụng để điều trị hàng loạt bệnh về cơ quan tạo máu và bệnh di truyền bẩm sinh có liên quan đến chuyển hoá và thiếu hụt miễn dịch. Máu dây rốn đã trở thành một trong ba nguồn cung cấp TBG tạo máu chính đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên lâm sàng [1],[21],[22],[23],[26],[57].
Hình 1.7. Dây rốn, mô kết nối người mẹ và thai nhi
Sau các nghiên cứu về TBG tạo máu trong máu dây rốn, các nghiên cứu khác cũng đã phát hiện và phân lập đƣợc các TBG trung mô từ máu dây rốn [1],[21],[32], từ màng ối từ lớp thạch (Wharton' jelly) [28],[126],[127].
Năm 2004, nhóm nghiên cứu tại Đại học Quốc gia Singapore đã thành công trong việc xác định và phân lập đƣợc các TBG biểu mô và TBG trung mô từ màng dây rốn. Theo nhóm tác giả này, ƣu điểm chính của việc phân lập
TBG từ màng dây rốn so với các phần khác của bánh nhau và dây rốn là thao tác kỹ thuật thuận tiện hơn, đồng thời thu đƣợc các TBG phong phú hơn cả về số lƣợng và chủng loại tế bào. Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trƣờng nuôi cấy đặc trƣng chƣa hề bị biệt hoá, vẫn giữ đƣợc đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập [119],[138]. Lợi thế của nguồn tế bào gốc từ màng dây rốn là đáp ứng đƣợc cả hai yêu cầu là số lƣợng tế bào và không vi phạm y đức. Mỗi dây rốn có đƣờng kính 1 cm và dài 55 cm thì diện tích bề mặt tƣơng đƣơng 330 cm2 với số lƣợng tế bào đƣợc phân lập trong 3 tuần sẽ đạt đƣợc 6 tỷ tế bào, đây thực sự là số lƣợng lý tƣởng cho các ứng dụng khác nhau trong y học tái tạo và công nghệ mô. Điều quan trọng nữa của công nghệ này liên quan đến chuyên ngành vết thƣơng và vật liệu thay thế da là ở chỗ các tế bào gốc từ màng dây rốn bao gồm tế bào gốc trung mô và tế bào gốc biểu mô tƣơng đƣơng với thành phần của da là tế bào lớp trung bì và tế bào lớp biểu bì [119].
Cả hai loại tế bào gốc biểu mô và trung mô màng dây rốn đều có 2 loại marker là: Oct 4 (Octamer 4) và Nanog (Pluripotency Sustaining ES Cell Factor). Đây là các yếu tố cần thiết duy trì tế bào gốc phôi ở tình trạng không biệt hoá. Các marker này không biểu hiện ở các tế bào gốc tủy xƣơng, da, mỡ và máu cuống rốn. Điều này gợi ý cho thấy tính gốc của cả hai loại tế bào này cao hơn so với tính gốc của tế bào tuỷ xƣơng, máu cuống rốn hay các tế bào gốc trƣởng thành khác. Ngoài ra, tế bào gốc màng dây rốn cũng có các marker nhƣ: ABCG2 (ATP biding cassette, sub family G, member 2). CEA (Carcinoembryonic Antigen). AFP (Alpha Feto Protein). Đây là các protein liên quan sự phát triển của tế bào gốc phôi [119],[138],[143].
Các tế bào gốc màng dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp [6],[12],[119]. Các nghiên cứu miễn dịch về các marker bề mặt tế bào và HLA của tế bào gốc màng dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ
ngƣời mẹ. Ngoài việc tế bào gốc có ít kháng nguyên HLA lớp II, các tế bào gốc màng dây rốn còn bộc lộ HLA-G là loại kháng nguyên hoà hợp tổ chức có chức năng sinh lý là ức chế miễn dịch giúp cho thai nhi không bị phản ứng thải bỏ miễn dịch từ ngƣời mẹ (bản chất thai nhi khi nằm trong bụng mẹ cũng là một mô ghép khác gen đồng loài). Việc HLA-G bộc lộ trên bề mặt tế bào gốc phân lập từ màng dây rốn đã giúp cho chúng dễ đƣợc chấp nhận ở một cơ thể khác, vì thế tế bào gốc màng dây rốn có ƣu điểm hơn các loại tế bào gốc khác khi ghép cho một cơ thể khác [119],[138].
Nhƣ vậy, về khía cạnh miễn dịch ghép các vật liệu thay thế da đƣợc chế tạo từ các nguồn tế bào gốc màng dây rốn sẽ có ƣu điểm nổi trội hơn rất nhiều so với các vật liệu thay thế da đƣợc chế tạo từ các tế bào da đồng loài đang đƣợc dùng hiện nay. Do tế bào da đồng loài, nhất là tế bào sừng, có khả năng kích thích sinh miễn dịch thải ghép rất mạnh nên thông thƣờng việc ghép vật liệu thay thế da bằng các nguồn tế bào này hoặc thậm chí ghép da đồng loài thì khả năng tồn tại của mảnh ghép đó trên vết thƣơng cũng chỉ trong vòng 2- 3 tuần và các lần ghép sau thì thời gian tồn tại trên vết thƣơng càng ngắn.
Các TBG trung mô màng dây rốn đƣợc khảo sát với một panel các dấu ấn bề mặt khác nhau bằng kỹ thuật flowcytometry với kháng thể đặc hiệu. Kết quả phân tích định tính cho thấy TBG trung mô màng dây rốn âm tính với các dấu ấn CD14, CD34, CD45 và HLA-DR; dƣơng tính với các dấu ấn CD13, CD44, CD90 và CD166 [4],[119]. Đây là kiểu hình chung cho nhiều TBG trung mô đã đƣợc phân lập từ máu dây rốn, tủy xƣơng [75],[138],[133], [137],[140],[141]. Đặc trƣng của tế bào gốc tủy xƣơng là CD23 và STRO-1 [35],[55],[120] nhƣng Phan TT và cộng sự thấy tế bào gốc dây rốn có CD23 nhƣng không có STRO-1 [120],[139].
Tác giả Troyer và Weiss đã đề cập đến nhiều dấu ấn tế bào qua công trình đã xuất bản về loại tế bào dạng này thu đƣợc từ dây rốn, nghiên cứu này cũng đã xác định tính đa tiềm năng của tế bào trung mô dây rốn [29],[35]. Tổng hợp lại từ các công trình đó thấy rằng đã có rất nhiều chỉ tiêu xét nghiệm dấu ấn tế bào để khẳng định tính gốc của tế bào trung mô dây rốn trong đó có cả các dấu ấn mang tính đặc thù của tế bào gốc nói chung nhƣ OCT3/4, Nanog. Do đó có thể nói tế bào gốc trung mô này thực sự là loại tế bào trung mô đa tiềm năng (multipotent mesenchymal stroma cells) [119]. Tế bào gốc trung mô dây rốn có các biểu hiện đặc thù của các tế bào gốc trung mô về hàng loạt các đấu ấn thể hiện tính gốc đã đƣợc mô tả ở tế bào thu đƣợc tại một số loại mô khác của cơ thể. Tế bào gốc dây rốn có nhiều dấu ấn mà các tế bào gốc trung mô ở mô khác không có [121],[123],[139]. OCT4 và Nanog đƣợc mọi ngƣời chấp nhận là những phân tử thể hiện tính gốc rõ rệt của tế bào [119],[138]. Cả hai phân tử này cũng đều biểu hiện ở tế bào gốc trung mô màng dây rốn [16],[70] và đây cũng là cơ sở khẳng định tế bào này có tính gốc mạnh hơn so với các tế bào trung mô khác .
Từ những ƣu điểm của tế bào gốc trung mô dây rốn, cùng với nhu cầu điều trị vết thƣơng vết bỏng, chúng tôi tiến hành đề tài để khảo sát một số đặc
điểm của tế bào gốc trung mô có liên quan đến liền vết thƣơng. Với những kết quả khảo sát đó, chúng tôi hy vọng sẽ có những định hƣớng tích cực trong việc cấy ghép tế bào gốc trung mô hoặc chế tạo vật liệu thay thế da từ tế bào gốc trung mô nhằm cải thiện và nâng cao chất lƣợng điều trị vết thƣơng vết bỏng hiện nay.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Thỏ thí nghiệm bao gồm 02 lô:
Lô 1, gồm 15 thỏ dùng để đánh giá tính sinh miễn dịch của tế bào gốc trung mô màng dây rốn ngƣời khi ghép dị loại.
Lô 2, gồm 30 thỏ dùng để đánh giá hiệu quả ghép tấm tế bào gốc trung mô điều trị vết bỏng nhiệt thực nghiệm.
Thỏ thí nghiệm đều đã trƣởng thành từ 10-12 tháng tuổi, do Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phòng cung cấp.
Trƣớc khi thí nghiệm thỏ đƣợc theo dõi từ 2-3 ngày, lựa chọn theo tiêu chuẩn: Khỏe mạnh, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mƣợt, không có bệnh ngoài da, không có bệnh đƣờng ruột, cân nặng từ 2 kg - 2,5 kg.
Nuôi đảm bảo tiêu chuẩn thực nghiệm.
Trong thời gian thực nghiệm thỏ đƣợc nhốt riêng mỗi con một chuồng, có đánh số để theo dõi, chế độ ăn uống đƣợc bảo đảm giống nhau gồm cơm và rau tƣơi.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1. Mẫu mô dây rốn 2.2.1. Mẫu mô dây rốn
Mô dây rốn thu từ sản phụ ngay sau khi sinh với các tiêu chuẩn nguồn mô nhƣ sau:
- Tiêu chuẩn y đức về nguồn cung cấp mô: Sản phụ đồng ý cung cấp dây rốn phục vụ nghiên cứu. Sản phụ đƣợc thông báo bởi nhóm nghiên cứu về mục đích sử dụng mô dây rốn do sản phụ cung cấp. Mô dây rốn chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu điều trị vết thƣơng, vết bỏng mà không nhằm
mục đích thƣơng mại hóa. Sản phụ đồng ý cung cấp miễn phí dây rốn mà không đòi hỏi về lợi ích kinh tế.
- Tiêu chuẩn sàng lọc: Ngƣời hiến mô dây rốn đạt tiêu chuẩn ngƣời hiến mô nói chung theo quy định Luật hiến mô của Quốc Hội nƣớc cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định của chính phủ hƣớng dẫn thực hiện việc hiến và ghép mô và danh mục của Bộ y tế về tiêu chuẩn bệnh lý của ngƣời hiến mô.
- Ngƣời hiến dây rốn thử máu âm tính với các bệnh truyền nhiễm sau:
STT Bệnh lý Kết quả
1 HIV Âm tính
2 HBV Âm tính
3 HCV Âm tính
4 Giang mai Âm tính
- Tính pháp lý của nguồn mô nghiên cứu
Mỗi nguồn cung cấp mô đều có các hồ sơ cung cấp mô gồm, họ tên sản phụ, địa chỉ liên lạc, ý kiến đồng ý cung cấp mô và kết quả xét nghiệm hoặc thăm khám trƣớc sinh, hồ sơ các xét nghiệm sàng lọc. Hai loại hồ sơ này đƣợc lƣu trữ tại khoa Labo nghiên cứu ứng dụng điều trị bỏng- Viện Bỏng Quốc Gia.
2.2.2. Hóa chất chủ yếu dùng trong nghiên cứu
DMEM high glucose (Dulbeco’s Modified Eagle Media); DMEM-F12(Dulbeco’s Modified Eagle Media – F12) PBS (Phosphate – Buffered Salines);
Trypsin – EDTA (0,005% Trypsin, 0,53mM EDTA .Na): dung dịch gồm 0,5g/L trypsin và 0,2g/L EDTA.4Na trong dung dịch Hanks’ không có CaCl2
;
FBS (Fetal Bovine Serum); DMSO (dimethyl sulfoxide); L-Glutamin
Vitamin C TGF-beta,
Insulin-like growth factor (IGF)-II EGF (Epidermal Growth Factor) Insulin,
Dung dịch Trypsin 0,05% và EDTA 0,53 mM trong dung dịch PBS Các hoá chất và vật tƣ nuôi cấy do hãng Invitrogen và PAAcung cấp, đều đạt tiêu chuẩn quốc tế an toàn về độc tính, vi khuẩn, mycoplasma và vi rút.
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào trung mô do Ngân hàng tế bào gốc Mekostem (Việt Nam) cung cấp theo bản quyền chuyển nhƣợng của công ty CRC (Singapore).
2.2.3. Các vật tƣ tiêu hao chủ yếu
Flash nuôi cấy tế bào loại 75cm2
và 25cm2. Đĩa petri loại D30, D60, D100;
Đĩa nuôi cấy 6 giếng, 12 giếng.
Pipet loại 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL; Ống ly tâm loại 15 mL, 50 mL;
Ống bảo quản tế bào lạnh sâu loại 1,2 mL; Màng Tegaderm,
Các vật tƣ tiêu hao do hãng Corning, 3M, Baxter cung cấp đạt tiêu chuẩn quốc tế về vô trùng và phục vụ mục đích nuôi cấy tế bào.
2.2.4. Các thiết bị và dụng cụ chủ yếu
- Kính hiển vi đảo ngƣợc - Máy ly tâm lạnh
- Tủ hood lọc không khí vô trùng - Tủ ấm (incubator)
- Pipet Aid
- Tủ lạnh gia dụng
- Tủ lạnh âm 860C và âm 1520C - Tank Nitơ lỏng
- Thiết bị hạ nhiệt độ theo chƣơng trình hoặc hộp hạ nhiệt độ với cồn PIA. - Nỉa, kéo
2.2.5 Các giá đỡ để tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì.
Màng Tegaderm chất liệu polyurethane do hãng 3M Health Care, USA cung cấp đƣợc dùng để làm giá đỡ tế bào.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu trong phân lập, nuôi cấy và biệt hóa tế bào tế bào
2.3.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô
Tại Labo nuôi cấy, dây rốn đƣợc xử lý theo quy trình vô trùng. Rửa mô dây rốn bằng Betadin scrup nếu mô thu theo đƣờng đẻ tự nhiên. Cắt lọc dây rốn, loại bỏ lớp thạch và các mạch máu của dây rốn. Sát trùng màng dây rốn bằng cồn 70% thể tích. Rửa sạch mô bằng PBS để loại bỏ cồn và máu.
Các mẩu mô sau đó đƣợc đặt vào đĩa hoặc chai nuôi cấy nhựa với mật độ khoảng 1mẩu mô/5cm2
bề mặt nuôi cấy. Bổ sung môi trƣờng nuôi cấy vào đĩa nuôi, đây là môi trƣờng nuôi cấy tế bào gốc trung mô chuyên biệt do Mekostem cung cấp đƣợc nhƣợng quyền của công ty CRC Singapore.
Đặt đĩa nuôi trong tủ ấm và ẩm với 5% CO2 ở 370C. Thay môi trƣờng sau mỗi 2-3 ngày và theo dõi dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc cho đến khi thấy tế bào hình sao, hình thoi mọc ra khỏi mẩu mô. Khi số lƣợng tế bào đạt khoảng 50% độ che phủ bề mặt nuôi cấy thì tách tế bào bằng quy trình trypsin. Các tế bào đƣợc theo dõi dƣới kính hiển vi và đƣợc cấy chuyển sang đĩa khác ở mật độ 8000 tế bào/cm2. Sau đó tế bào đƣợc bảo quản lạnh sâu hoặc nhân rộng để làm các thí nghiệm hoặc ứng dụng tiếp theo.
Trong quá trình nuôi cấy mô, hàng ngày theo dõi dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc về: Thời gian tế bào tách khỏi mẫu mô, hình thái tế bào mới tách.
Sau khi cắt nhỏ thành các mẩu có kích thƣớc 0,2 x 0,2 cm, đặt các mẩu mô trong đĩa nuôi cấy nhựa và bổ sung môi trƣờng chuyên biệt đƣợc cung cấp từ Ngân hàng tế bào gốc Mekostem, đặt các đĩa mô vào tủ ấm 370C với 5% CO2. Thay môi trƣờng nuôi cấy từ 2-3 lần/ tuần và theo dõi đến khi các tế bào hình sao hay hình thoi tách ra khỏi mẫu mô và phát triển đạt 50%-70% bề mặt đĩa thì tiến hành tách tế bào bằng quy trình sử dụng trypsin. Các tế bào đƣợc nhân lên đến thế hệ cấy chuyển thứ 3-4 dùng vào nghiên cứu chế tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì.
Hình 2.1. Cấu trúc mô dây rốn
Lớp tế bào biểu mô tương tự màng ối (1); lớp tế bào gốc trung mô màng dây rốn (2); lớp tế bào gốc trung mô lớp Wharton’ jelly (3). Các tế bào được sử
dụng trong nghiên cứu này thuộc vị trí số 2.
* Nguồn: theo Katsuhiro Kita và Cs (2009) [90]
2.3.1.2. Cấy chuyển nhân rộng số lƣợng tế bào gốc trung mô dây rốn
Tách và nhân rộng số lƣợng tế bào đƣợc áp dụng theo quy trình cấy chuyển có sử dụng trypsin, các bƣớc nhân rộng đƣợc mô tả chi tiết nhƣ sau:
Kiểm tra cẩn thận tình trạng tế bào nuôi cấy để phát hiện các dấu hiệu bị ô nhiễm. Đánh giá sơ bộ mật độ tế bào bằng mức độ phủ kín bề mặt (confluence), pH môi trƣờng...trƣớc khi tiến hành cấy chuyển.
Hút bỏ dịch nổi trong chai nuôi cấy. Rửa bề mặt đĩa nuôi cấy tế bào bằng dung dịch đệm PBS với số lƣợng 0,2 ml/cm2
.
Thêm dung dịch Trypsin/EDTA với số lƣợng 0,1mL/cm2. Đặt chai hoặc đĩa nuôi cấy vào tủ ấm theo dõi 5-10 phút, cho thêm 0,1 – 0,2 mL/cm2
môi trƣờng nuôi cấy, thu tế bào vào ống ly tâm, đếm số lƣợng tế bào. 1
2 3
4
Ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong khoảng thời gian 10 phút. Hút bỏ dịch nổi sau ly tâm, cho thêm môi trƣờng nuôi cấy.
Khối tế bào thu đƣợc sẽ đƣợc dùng vào các thí nghiệm tiếp theo hoặc cấy chuyển sang chai khác mật độ 5000 TB/cm2
hoặc đƣợc bảo quản lạnh sâu.
2.3.1.3. Đánh giá khả năng tạo colony của tế bào
Khả năng tạo colony của tế bào mới tách đƣợc đánh giá nhƣ sau:
- Tế bào mới tách ra khỏi mẫu mô, mật độ tế bào đạt khoảng 50% độ