Thời điểm
Tỷ lệ vết thƣơng có mẫu cấy khuẩn dƣơng tính Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Số mẫu (+) Tỷ lệ % Số mẫu (+) Tỷ lệ % D0 1 3,33 3 10,00 D5 5 16,67 7 23,33 D10 4 13,33 3 10,00 Tổng 10 33,33 13 43,33
Tần xuất cấy khuẩn dƣơng tính ở vùng nghiên cứu không cao hơn so với vùng đối chứng.
2 1
30% 40% 10% 10% 10% E.cloaceae E.coli S.aureus P.mirabilis K.pneumoniae
Biểu đồ 3.7. Chủng loại vi khuẩn vết thƣơng vùng nghiên cứu (Vùng A)
15.38% 7.69% 7.69% 7.69% 15.38% 38.48% 7.69% E.cloaceae E.coli S.aureus P.mirabilis K.pneumoniae Aci. Baumannii Shi.boydi
Qua biểu đồ 3.7 và 3.8 cho thấy:
- Chủng loại vi khuẩn vùng A bao gồm: E. cloaceae, E. coli, S. aureus, P. mirabilis, K, pneumonia. Trong khi đó, ở vùng B gặp các loài vi khuẩn là: Aci. Baumanni, E.coli, E.cloaceae, Shi.boydi, P.mirabilis, S. aureus, K.pneumoniae
- Tỷ lệ vết thƣơng nhiễm khuẩn E.coli và E.cloaceae chiếm cao hơn các chủng vi khuẩn khác.
Bảng 3.22. Thay đổi số lượng vi khuẩn vết thương
Thời điểm Số lƣợng vi khuẩn (5103/cm2) Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) P D0 05,67 ± 31,07 9,02 ± 28,40 0,575 D5 16,06 ± 37,15 22,87 ± 42,98 0,108 D10 10,57 ± 27,96 7,22 ± 22,21 0,343
Xét tại vùng A và vùng B thì số lƣợng vi khuẩn tăng cao ở lần 2 (thời điểm 5 ngày sau khi bắt đầu ghép tế bào) nhƣng sau đó giảm ở lần 3 (ngày thứ 10 sau khi ghép tế bào).
0 5 10 15 20 25 D0 D5 D10 Vùng A Vùng B
Biểu đồ 3.9. Thay đổi số lƣợng vi khuẩn tại vết bỏng
Số lƣợng vi khuẩn trên 1cm2 vết thƣơng ở hai vùng nghiên cứu không có sự khác biệt tại các thời điểm lấy mẫu xét nghiệm.
Cả 2 vùng vết thƣơng đều có mật độ vi khuẩn thấp nên ít có khả năng ảnh hƣởng đến quá trình liền vết thƣơng.
Vết thƣơng đƣợc ghép tấm tế bào cũng không làm tăng sự phát triển vi khuẩn tại vết thƣơng mặc dù không sử dụng thuốc kháng khuẩn tại chỗ vết thƣơng.
CHƢƠNG 4 BÀN LUẬN
4.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN
4.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô màng dây rốn
Tế bào gốc trung mô, lớp tế bào gốc thuộc trung bì có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào [54]. Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể dễ dàng thu đƣợc. Do việc sử dụng chúng không bị các vƣớng mắc về vấn đề đạo đức, dây rốn là sự lựa chọn tối ƣu cho việc phân lập tế bào gốc trung mô [6],[14],[119]. Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng đặc tính sinh học và hình thái tế bào của tế bào gốc trung mô dây rốn rất giống tế bào gốc trung mô tủy xƣơng và tế bào gốc trung mô dây rốn có thể biệt hóa thành tế bào cơ tim, mỡ, và thần kinh [46], [54],[55]. Tuy nhiên, khả năng tăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc trung mô dây rốn tốt hơn nhiều so với tế bào gốc trung mô tủy xƣơng [56]. Hochedlinger và cộng sự [57] đã xác định OCT-4 cũng có biểu hiện ở các tế bào gốc trung mô dây rốn. OCT-4 là một gene đặc biệt của tế bào gốc phôi, có vai trò quan trọng trong việc duy trì tình trạng không biệt hóa của tế bào gốc. Kết quả này chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô sơ hữu ít nhất là một số đặc tính của tế bào gốc. Hơn nữa, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô có thể hữu ích trong tái tạo vết thƣơng và trong y học tái tạo [58], [59].
Trong nghiên cứu này, tế bào gốc trung mô giống nguyên bào sợi đƣợc tinh lọc thu đƣợc thông qua phƣơng pháp có thay đổi chút ít so với phƣơng pháp đã mô tả và xuất bản trƣớc đây [60]. Đối với nguồn tế bào gốc trung mô ngƣời, lớp thạch đƣợc phân tách thay cho việc dùng toàn bộ mô dây rốn để tránh nhiễm tế bào biểu mô. Khi tách tế bào gốc trung mô dây rốn bằng
phƣơng pháp này, nhiều cách thức khác cũng đƣợc khảo sát nhƣ dùng collagenase, trypsin, hyaluronidase.[61], [89], [92].
Nghiên cứu của chúng tôi không sử dụng enzyme để phân lập tế bào mà sử dụng phƣơng pháp kết dính mô vào bề mặt nuôi cấy để các tế bào tự mọc ra khỏi mẫu mô. Một số nghiên cứu trƣớc đây cũng đã áp dụng mô hình phân lập tế bào gốc tƣơng tự mà không cần dùng enzyme [136],[137]. Với phƣơng pháp này, Lê Văn Đông và cộng sự, sau khi nuôi cấy mô, 100% số mẫu có tế bào mọc lan ra khỏi mẩu mô, mẫu xuất hiện tế bào sớm nhất vào ngày 3 và muộn nhất vào ngày 17. Sau khi nuôi cấy vài ngày, các mảnh mô co lại, bám chặt hơn vào bề mặt đĩa nuôi và bắt đầu xuất hiện các tế bào lan ra xung quanh rìa mép của mảnh mô [14].
Kết quả của chúng tôi tƣơng đối phù hợp với tác giả trên, có 15/17 mẫu mô nghiên cứu mọc tế bào ra khỏi mẩu mô trong 3 tuần sau nuôi cấy mô, đạt tỷ lệ 88,2% và cũng chỉ cần nuôi cấy trong hai tuần là đã có thể thu hoạch tế bào. Khoảng 10-14 ngày sau khi bắt đầu cấy mô, có dấu hiệu một số tế bào di cƣ từ mẩu mô nuôi cấy ra bề mặt đĩa nhựa. Các tế bào dây rốn mọc ra khỏi mẫu mô trong điều kiện nuôi cấy có đặc điểm về hình thái là tế bào có hình sao hoặc hình thoi chiếm chủ yếu, có phát hiện một số tế bào có hình ovan hoặc hình đa diện nhƣng ít. Không thấy có kết nối nhánh bào tƣơng khi quan sát ở độ phóng đại lớn. Tế bào có dấu hiệu phát triển lan rộng ra khỏi mẫu mô ở dạng đơn lớp mà không thấy sự biệt hóa nhiều lớp.
Kết quả nghiên cứu các dấu ấn bề mặt tế bào cho thấy tế bào gốc trung mô có biểu hiện mạnh các dấu ấn CD44, CD29, CD105, và HLA-ABC, nhƣng không có CD34, HLA-DR, CD31 hoặc CD45 [62],[63],[65],[66]. Nhƣ vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn biểu hiện các kháng nguyên đặc biệt của tế bào trung mô mà không biểu hiện dấu ấn tế bào gốc tạo máu hay tế bào nội mô. Kết quả về hình thái tế bào, dấu ấn bề mặt và khả năng biệt hóa nhiều
dòng tế bào nói chung đƣợc sử dụng nhƣ các chỉ tiêu đánh giá để xác định tế bào gốc trung mô. Dựa vào những kết quả trên đây, chúng tôi tin rằng các tế bào bám dính bề mặt nuôi cấy đƣợc phân lập từ dây rốn đúng là tế bào gốc trung mô, mà đã đƣợc cho rằng tế bào gốc trung mô cũng tồn tại ở dây rốn cũng nhƣ ở tủy xƣơng và các mô khác [90],[119].
Kết hợp kết quả nghiên cứu của các tác giả khác với việc khảo sát của chúng tôi, có thể khẳng định tế bào gốc trung mô màng dây rốn có tính gốc mạnh hơn so với các tế bào trung mô khác .
4.1.2. Một số đặc tính của tế bào gốc trung mô dây rốn
4.1.2.1. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn
Để xác định khả năng tăng trƣởng của tế bào gốc trung mô, chúng tôi tiến hành phân tích khả năng tạo colony (CFU-F). Tế bào tách từ 5 mẫu mô đƣợc thử khả năng tạo CF-E đều thấy xuất hiện các collony. Các collony đều có thể thấy xuất hiện sớm trong vòng 05 ngày thí nghiệm, các colony lúc này có khoảng 3-4 tế bào và đã thấy rõ trong vòng 10 ngày.
Tỷ lệ colony trong tập hợp số tế bào tách ra khỏi mẫu mô đạt cao, thấp nhất là 66% và cao nhất là 77%. Các mẫu nghiên cứu cho thấy, tế bào gốc trung mô phát triển tốt và tạo ra số lƣợng lớn các colony (gần 30 colonies) và đƣờng kính của colony cũng đạt hơn 2mm..
Nhƣ vậy, nghiên cứu này chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc duy trì khả năng di truyền. Kích thƣớc colony lớn cũng gợi ý rằng chúng có khả năng tăng sinh và cả khả năng di cƣ.
4.1.2.2. Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp
Đặc điểm kháng nguyên HLA ở tế bào gốc trung mô dây rốn
Kết quả ở biểu đồ 3.2 cho thấy, trên 98% số tế bào thuộc quần thể TBGTM màng dây rốn nằm trong vùng M1, là vùng âm tính với tín hiệu huỳnh quang FITC gắn với kháng thể kháng HLA-DR. Trong khi đó, trên
92% số tế bào này nằm trong vùng M2 khi phân tích với kháng thể kháng CD90, thể hiện các tế bào này dƣơng tính với CD90 là một dấu ấn đặc trƣng của TBGTM đƣợc dùng nhƣ chứng dƣơng trong cùng lần phân tích. Điều này cũng tái khẳng định tế bào đƣợc phân tích là TBGTM. Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức độ biểu hiện của HLA chỉ ở mức 1,95 ± 1,53%.
Theo qui ƣớc của Ủy ban Tế bào gốc mô và trung mô của Hội Liệu pháp tế bào quốc tế (ISCT), một marker đƣợc cho là âm tính khi đánh giá bằng kỹ thuật flowcytometry phải có tỉ lệ phần trăm dƣơng tính nhỏ hơn 2% trong tổng số tế bào dƣơng tính [5]. Từ đó cho thấy, TBGTM màng dây rốn đƣợc phân tích trong nghiên cứu này âm tính với HLA-DR. Kết quả nghiên cứu này cũng tƣơng tự nhƣ các ghi nhận của của Miki và CS (2005) với tế bào biểu mô màng ối [7] và Deuse và CS (2011) với tế bào gốc màng dây rốn [5], đều là các tế bào có nguồn gốc nhũ nhi.
HLA-G và HLA-E là các phân tử HLA thuộc lớp HLA lớp I, bộc lộ chủ yếu ở các tế bào của thai nhi, có tác dụng ức chế miễn dịch giúp cho thai nhi tồn tại đƣợc trong cơ thể ngƣời mẹ [8]. HLA-DR là kháng nguyên thuộc HLA lớp II, có tính sinh miễn dịch mạnh khi đƣợc cấy ghép vào cơ thể dị gen [3]. Các kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này, một lần nữa cho thấy, việc tồn tại các phân tử HLA-G và HLA-E nhƣng không bộc lộ HLA-DR trên các TBGTM màng dây rốn đã cung cấp một “đặc ƣu miễn dịch” giúp cho các TBG này dễ đƣợc dung nạp khi cấy ghép vào cơ thể khác gen [5],[9]. Điều này giúp giải thích đƣợc hiện tƣợng kích thích miễn dịch yếu và không bền vững khi ghép TBGTM màng dây rốn ngƣời lên da thỏ trong nghiên cứu trƣớc của chúng tôi [15].
TBGTM màng dây rốn trẻ sơ sinh bộc lộ các phân tử HLA-G và HLA-E nhƣng không bộ lộ HLA-DR. Đặc điểm biểu hiện này về HLA có thể là một phần nguyên nhân tạo nên tính sinh miễn dịch thấp của loại tế bào gốc này.
Khi cấy ghép tế bào từ cơ thể này sang cơ thể khác luôn có hiện tƣợng cơ thể nhận sinh đáp ứng miễn dịch chống lại các tế bào khác gen đã đƣợc ghép vào. Trong nghiên cứu này, tất cả các mẫu huyết thanh thỏ ở các thời điểm đƣợc khảo sát là D15, D30 và D60 đều có hoạt tính kháng thể kháng TBGTMMDRN đƣợc cấy ghép, chứng tỏ các tế bào này có tính sinh miễn dịch. Mặc dù TBGTMMDRN đƣợc cho là có các yếu tố góp phần làm cho tính sinh miễn dịch thấp [6],[14], nhƣng có thể việc cấy ghép tế bào trong nghiên cứu này là ghép dị loài tế bào ngƣời vào thỏ nên có nhiều khác biệt về các quyết định kháng nguyên giữa hai loài tồn tại trên các TBGTMMDRN. Bên cạnh đó, việc cấy ghép lặp lại liên tục 7-8 lần cũng có thể góp phần tăng cƣờng khả năng sinh miễn dịch. Mặc dù vậy, hoạt tính kháng thể là không mạnh và giảm đi rõ rệt sau các ngày D30 và D60, chứng tỏ đáp ứng tạo kháng thể này là không bền vững.
Kháng nguyên HLA đã đƣợc biết là tác nhân sinh đáp ứng miễn dịch thải ghép. HLA là các phân tử có trên bề mặt tế bào nguyên vẹn, tuy nhiên, khi so sánh hoạt tính kháng thể phản ứng với kháng nguyên siêu nghiền lại mạnh hơn so với tế bào nguyên vẹn, điều này chứng tỏ bên cạnh HLA còn có các kháng nguyên khác từ bên trong tế bào cũng kích thích cơ thể thỏ sinh ra kháng thể. Kết quả này gợi ý cần cấy ghép các tế bào khỏe mạnh cũng nhƣ chuẩn bị nền vết thƣơng có mạch máu nuôi dƣỡng tốt có thể góp phần làm tăng khả năng sống sót của tế bào sau ghép, đồng thời làm giảm khả năng sinh đáp ứng miễn dịch thải ghép. Mặc dù vậy, vẫn cần có các nghiên cứu sâu hơn nữa trƣớc khi có thể khẳng định đƣợc giả thuyết này.
Nhƣ vậy, tế bào gốc trung có biểu hiện các kháng nguyên HLA - G, HLA-E, đây là những kháng nguyên gây ức chế miễn dịch. Các kháng thể kháng tế bào gốc ở thỏ không cao và kém bền vững. Các kết quả từ nghiên cứu này cho phép gợi ý về khả năng có thể sử dụng TBGTM màng dây rốn để cấy ghép khác gen đồng loại trong các ứng dụng khác nhau.
4.1.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành dạng nguyên bào sợi
Tế gào gốc trung mô dây rốn đã đƣợc phân lập và thu đƣợc trong thực tế. Chúng tránh đƣợc các vấn đề đạo đức khi nghiên cứu và sử dụng trong các trị liệu. Hơn nữa, chúng lại có tiềm năng lớn trong biệt hóa thành các tế bào khác nhau và có khả năng tăng sinh mạnh mẽ. Tế bào gốc trung mô dây rốn đƣợc coi là nguồn tế bào gốc đầy hứa hẹn cho y học tái tạo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu dây rốn trong điều kiện vô trùng sau đó phân lập tế bào gốc theo phƣơng pháp nuôi cấy bám dính của mô. Phƣơng pháp này đã đƣợc nhiều tác giả sử dụng để phân lập tế bào gốc trung mô dây rốn và xác định đặc tính của chúng [40],[41],[42] .
Trong một nghiên cứu gần đây, nhóm tác giả tiến hành biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành nguyên bào sợi da cùng với các phƣơng pháp đánh giá hiện đại nhƣ: Các marker của bề mặt tế bào đƣợc xác định bằng flow cytometry, xác định các protein đặc hiệu bằng hóa miễn dịch huỳnh quang, xác định bằng hóa mô miễn dịch với kháng thể đơn dòng cho nguyên bào sợi và PCR với collagen typ I và III [41]. Trong lần cấy chuyển thứ 3, tế bào gốc trung mô đƣợc điều khiển biệt hóa thành nguyên bào sợi da trong môi trƣờng định hƣớng. Phƣơng pháp này cũng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng nuôi hệ thống nuôi cấy đơn lớp và môi trƣờng định hƣớng chỉ khác là các tác giả dùng thế hệ thứ 3 còn chúng tôi dùng từ thế hệ tế bào
thứ 5. Kết quả của các tác giả cho thấy tế bào gốc trung mô biểu hiện hình thái giống nhƣ nguyên bào sợi, thời gian đạt 90% độ che phủ vào ngày thứ 14-18 sau nuôi cấy sơ cấp. Tế bào gốc trung mô cho dƣơng tính mạnh với CD73, 29, 44 và 105 và HLA-1 nhƣng âm tính với CD 34, 45, 31 và HLA- DR. Sau biệt hóa, nhuộm hóa mô miễn dịch với collagen typ I và III, các protein đặc biệt của nguyên bào sợi là vimentin và desmin dƣơng tính mạnh ở các tế bào biệt hóa và yếu hoặc âm tính ở các tế bào chƣa biệt hóa [41].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào quan sát các biến đổi hình thái của tế bào biệt hóa so với tế bào gốc trung mô cả trên kính hiển vi đảo ngƣợc và cả nhuộm tế bào. Tế bào gốc trung mô ban đầu khi đơn lẻ có tỷ lệ tế bào hình sao với nhiều nhánh bào tƣơng trảo rộng chiếm chủ yếu. Sau khi biệt hóa, chúng trở nên thuôn dạng hình thoi với nhân hình ovan đặc trƣng của nguyên bào sợi và nếu nuôi trong môi trƣờng có vitamine C thì chúng nhanh biến đổi thành dạng sợi thuôn dài với khoảng bào tƣơng hẹp. Khi xét nghiệm hóa miễn dịch huỳnh quang với protein đặc hiệu của nguyên bào sợi là vimentin, tế bào biệt hóa cũng cho kết quả dƣơng tính.
Tổng hợp đệm gian bào là một trong những đặc tính cơ bản của nguyên bào sợi. Chúng tạo ra collagen, elastin…hay các glycosaminoglycan. Trong