Số lá mở trên cây không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức. Tuy nhiên, khi quan sát lá cây qua các ngày nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt về độ dày và màu sắc lá ở các ngày nuôi cấy. Lá cây húng chanh nuôi cấy ở ngày thứ 35 dày và có màu xanh đậm hơn. Ở ngày thứ 45 lá mỏng và màu nhạt hơn so với lá cây húng chanh ở các ngày 25 và 35 (Hình 4.8, 4.9).
Chi ều cao cây (mg/cây) Ngày
50
Diện tích lá ở các thời gian nuôi cấy khác nhau có giá trị tương đương nhau và không có ý nghĩa về mặt thống kê (Bảng 4.2).
Bảng 4.3: Hàm lượng chlorophyll của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy
Tên Chl.a Chl.b Chl a+b Chl a/b
NTz (mg/mg lá khô) (mg/mg lá khô) (mg/mg lá khô)
25 14,1 6,1 20,2 2,3 35 14,4 6,5 20,9 2,2 45 15,6 7,4 23,0 2,1 ANOVAx NS NS NS NS CV (%) 11,5 6,9 9,4 8,4 x : NS: không khác biệt z
:Tên nghiệm thức: 25, 35, 45 tương ứng với thời gian nuôi cấy 25 ngày, 35 ngày và 45 ngày
4.1.9. Hàm lƣợng chlorophyl l a, b, a + b và a/b 25 35 45 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Chl a Chl b
Hình 4.7: Hàm lượng chlorophyll a và b của cây húng chanh ở các ngày nuôi cấy khác nhau
Các hàm lượng chlorophyll a, b, a + b và a/b đều không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Hàm lượng chlorophyll a/b ở tất cả các nghiệm thức (Bảng 4.3)
Hàm lư ợng chlorophyll (mg/mg lá khô) Ngày
51
cho thấy, cây húng chanh nuôi cấy trong hộp ở các thời gian khác nhau đều phát triển bình thường.
52
Hình 4.9: Cây húng chanh ở các ngày nuôi cấy 25, 35 và 45
4.1.10. Hiệu suất quang hợp thuần (Pn) (µmol mol-1 h-1/cây)
Hình 4.10: Số lần trao đổi khí của hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡngbơm khí trực tiếp 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 20 40 60 Số lần trao đổi khí (lần/ giờ ) Ngày
53
Hiệu suất quang hợp thuần tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên sự gia tăng không đồng đều giữa các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau, hiệu suất quang hợp thuần ở ngày thứ 34 (44,3 µmol mol-1 h-1/cây) cao hơn gấp 2,4 lần so với hiệu suất quang hợp thuần ở ngày thứ 24 (18,7 µmol mol-1 h-1/cây). Hiệu suất quang hợp thuần trong khoảng thời gian từ ngày thứ 34 đến ngày thứ 44 gia tăng ít hơn so
với giai đoạn 24 – 34, ở ngày thứ 44 hiệu suất quang hợp thuần (59 µmol mol-1 h-
1
/cây ) chỉ tăng lên 1,3 lần so với ngày thứ 34.
Ngày 0 10 20 30 40 50 P n ( m ol m ol -1 h -1 /cây ) 0 10 20 30 40 50 60 25 ngày 35 ngày 45 ngày
Hình 4.11: Hiệu suất quang hợp thuần của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy
54
4.2. Thảo luận
Trong nuôi cấy mô quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp, sự tăng trưởng của cây
in vitro rất rõ ràng và nhanh chóng hơn so với cây nuôi cấy mô truyền thống hoặc nuôi cấy mô quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên (Nguyen T. Q. và cộng sự, 2010). Đối với cây húng chanh, trong cùng thời gian nuôi cấy 45 ngày, cây húng chanh trong hệ thống bơm khí trực tiếp sử dụng hộp nuôi cấy thể tích 60l có GTTLT 7578,9 mg/cây, cao gấp 19 lần so với cây húng chanh nuôi cấy truyền thống sử dụng bao nilon (397,7 mg/cây) và cao gấp 4 lần so với cây húng chanh nuôi cấy quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên sử dụng bao nilon có gắn màng lọc (1783,9 mg/cây) của Hoàng Minh Tuấn (2009). GTTLK và chiều cao cây của húng chanh nuôi cấy trong hộp 60 l cũng cao hơn so với nuôi cấy mô truyền thống hay nuôi cấy quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên. Điều này là do độ ẩm tương đối trong bao nuôi cấy truyền thống cao làm cho cây húng chanh thoát hơi nước chậm dẫn đến tốc độ hấp thu nước và khoáng chất từ môi trường giảm sút, vì vậy cây tăng trưởng kém, đồng thời khả năng quang hợp của cây húng chanh trong nuôi cấy truyền thống thấp do nồng độ CO2 trong bao nuôi cấy truyền thống ở giai đoạn chiếu sáng luôn luôn thấp. Nồng độ đường cao trong môi trường nuôi cấy truyền thống làm cho lục lạp phát triển không bình thường (Wetztein và Sommer, 1982), dẫn đến hoạt động của enzym RuBisCO bị giới hạn (Grout, 1988; Hdider và Dejardins, 1994). Khi nuôi cấy húng chanh theo phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên, sự trao đổi khí giữa trong và ngoài bình nuôi cấy được tăng cường
nhưng vẫn ko đáp ứng được nhu cầu CO2 cho cây quang hợp theo thời gian của cây
vì vậy khi cây tiếp tục tăng trưởng thì lượng CO2 trong bình nuôi cấy không còn đáp ứng đủ cho sự quang hợp của cây, cây tăng trưởng chậm dần.
Trong hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp, hộp nuôi cấy có thể tích lớn hơn sẽ giúp cây tăng trưởng tốt hơn. Điều này đã được chứng minh khi so sánh kết quả tăng trưởng của cây húng chanh trong hộp 60 l và hộp 17 l. Ở ngày thứ 45, cây húng chanh trong hộp nuôi cấy có thể tích 17 l của Phạm Thành Thái (2010) có GTTLT là 2492,1 mg/cây, trong khi ở hộp 60 l của thí nghiệm này GTTLT là 7578,9 mg/cây. Chiều cao cây húng chanh ở ngày thứ 45 khi nuôi cấy trong hộp 60 l cao gấp 6 lần so với cây húng chanh khi nuôi cấy trong hộp 17 l
55
(28mm). Sự khác biệt này là do việc nuôi cấy trong hộp có thể tích lớn hơn mang lại lượng không khí trong đó có CO2 nhiều hơn
Quan sát sự tăng trưởng của cây húng chanh trong hộp nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp với thể tích 60 l cho thấy trong thời gian đầu của quá trình nuôi cấy (, cây tăng trưởng chậm do bộ máy quang hợp của cây chưa hoạt động trở lại bình thường sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường có đường phải tập thích nghi với việc tự dưỡng, vì vậy trong giai đoan 25 ngày đầu tiên cây phát triên chậm
Kết quả thí nghiệm cho thấy giai đoạn 25 ngày đầu tiên, cây phát triển chậm, GTTLT 3655,8 mg/hộp, đây là giai đoạn cây bắt đầu làm quen với với điều kiện môi trường mới và quá trình tự dưỡng. Trong điều kiện môi trường không chứa đường, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cây phải dựa vào khả năng quang hợp để tổng hợp nguồn carbonhydrate . Trong tuần đầu tiên, cây chỉ thực hiện quá trình tái sinh và tạo chồi. Sau khi hình thành những lá đầu tiên, cây mới thực hiện quá trình quang hợp, vì vậy hiệu suất quang hợp thuần ở ngày thứ 25 thấp (18,7 µmol mol-1 h-1/cây).
Khi cây húng chanh thích nghi với điều kiện môi trường mới và quá trình tự dưỡng, cây bắt đầu tăng trưởng nhanh. Điều này thể hiện ở các chỉ tiêu GTTLT và chiều cao cây của cây húng chanh. Thời gian chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng 250 µmol m-2 s-1 cùng với lưu lượng khí tăng lên 5 l/ph, đáp ứng nhu cầu về ánh sáng và CO2 cho quá trình quang hợp của cây húng chanh in vitro, hiệu suất quang hợp thuần tăng lên nhanh trong giai đoạn 25 đến 35 ngày (Biểu đồ 4.10). Zobayed (1999) cũng thu được kết quả tương tự khi sử dụng hộp nuôi cấy 3,5 l, tăng lưu lượng khí bơm vào hộp giúp tăng hiệu suất quang hợp thuần của cây khoai lang. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự (2009) cho thấy hiệu suất
quang hợp thuần của cây lan Dendrobium khi sử dụng hộp nuôi cấy bơm khí trực
tiếp thể tích 7 l và 17 l cao hơn so với các bình nuôi cấy trao đổi khí tự nhiên có thể tích 370 ml. Như đã biết, quá trình quang hợp là quá trình thực vật sử dụng năng lượng ánh sáng và nguồn carbon vô cơ để tổng hợp chất hữu cơ cho cơ thể, hiệu suất quang hợp tăng, sự tổng hợp chất hữu cơ tăng giúp cây tăng trưởng nhanh chóng.
56
Tuy gia tăng trọng lượng tươi ở ngày thứ 35 cao gấp 2 lần so với ngày 25 nhưng trọng lượng khô ở ngày 35 chỉ gia tăng gấp 1,6 lần so với ngày thứ 25. Điều này chứng tỏ lá cây húng chanh ở ngày 35 chứa nhiều nước hơn. Trọng lượng khô biểu hiện cho khả năng tích lũy sinh khối của cây, trọng lượng khô của cây húng chanh trong nuôi cấy quang tự dưỡng tăng theo thời gian nuôi cấy từ 25-35 cho thấy nhu cầu CO2 và ánh sáng , như vậy sinh khối được tích lũy ngày càng nhiều trong cây húng chanh.
Từ 35 - 45 tốc độ tăng trưởng của cây chậm dần. Với thể tích hộp nuôi cấy 60 l và số cây nuôi cấy trong hộp 152 cây/ hộp, ở ngày thứ 35 trong hộp nuôi cấy đã không còn khoảng không gian trống (hình 4.1). Khi nuôi cấy đến thời gian 45 ngày, chiều cao cây bị giới hạn bởi chiều cao của hộp nuôi cấy. Sự gia tăng trọng lượng tươi, đường kính thân và số lá của cây húng chanh trong những ngày tiếp theo cản trở sự lưu thông khí cùng với việc gia tăng lưu lượng khí lên 18 l/ph vào ngày thứ
38 chưa đáp ứng được nhu cầu CO2 cho cây quang hợp. Lượng CO2 cung cấp cho
cây giảm cùng với thời gian chiếu sáng kéo dài và cường độ ánh sáng cao có thể làm ức chế quá trình quang hợp. Sự duy trì nồng độ CO2 thấp trong suốt thời gian chiếu sáng dài làm đã hạn chế khả năng quang hợp của cây khi tăng cường độ ánh sáng (Afreen và ctv, 2002), vì vậy cây húng chanh tăng trưởng chậm trong thời gian từ ngày thứ 35 đến ngày 45.
Số lá mở/cây không có sự khác biệt ở các thời gian nuôi cấy khác nhau là do lá ở gần gốc của cây húng chanh ở các thời gian nuôi cấy 35 ngày và 45 ngày bị vàng úa và rụng. Hiện tượng xuất hiện khi lá cây húng chanh không nhận được đủ ánh sáng . Khi cây húng chanh phát triển nhanh chóng trong hộp nuôi cấy, phần gốc cây húng chanh thường không nhận đủ ánh sáng do ánh sáng chiếu xuống bị chặn bởi phần ngọn và lá ở phía trên. Khi đó, quang hợp của cây húng chanh giảm, diệp lục tố không được hình thành trong lá, lá sẽ vàng và rụng.
Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/ rễ có sự khác biệt theo thời gian nuôi cấy, tỷ lệ này tăng dần khi thời gian nuôi cấy tăng, tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/rễ lại không có sự khác biệt giữa ngày 25 và 35 (Bảng 4.1), như vậy có sự phát triển không đồng đều giữa thân lá với sự phát triển của rễ đặc biệt là ở ngày thứ 45. Dù thân lá phát triển và gia tăng trọng lượng theo thời gian nuôi cấy nhưng chiều dài và trọng lượng
57
rễ lại tương đương nhau ở các ngày nuôi cấy, đó là do lớp perlite mỏng (khoảng 30 mm) hạn chế sự phát triển của rễ, rễ không thể đâm sâu mà hình thành nhiều rễ bên (hình 4.1). Kết quả tương tự cũng thu được khi nuôi cấy cây húng chanh theo phương pháp quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp trong hộp nuôi cấy thể tích 17 l (Phạm Thành Thái, 2010).
Sự biến thiên GTTLT của cây húng chanh trong hộp nuôi cấy 60 l cho thấy của cây húng chanh tăng trưởng không đều ở các vùng của hộp nuôi cấy. Sự tăng trưởng không đều của cây húng chanh trong hộp nuôi cấy có thể do sự phân phối khí không đồng đều giữa các vùng trong hộp nuôi cấy, Đầu khí vào dạng ống thẳng, khi bơm khí vào hộp không khí có thể có xu hướng đi theo đường thẳng sau đó mới khuếch tán ra xung quanh, vì vậy cây húng chanh ở vùng sát 2 đầu khí vào nhận được lượng CO2 thấp hơn các vùng khác nên có gia tăng trọng lượng thấp hơn.
Với thiết kế hộp 60 l, thời gian nuôi cấy cây húng chanh trong điều kiện quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp thích hợp là 35 ngày. Sau thời gian này, cây tăng trưởng chậm. Tuy nhiên cần khảo sát sự tích lũy hợp chất thứ cấp của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy để có thể xác định được thời gian nuôi cấy tối ưu cần thiết cho cây tăng trưởng cũng như gia tăng hàm lượng hợp chất hữu cơ trong cây.
58
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp có thể điều chỉnh thời
gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và gia tăng lưu lượng khí theo thời gian nuôi cấy, tăng hiệu suất quang hợp của cây nhờ đó cây có thể tăng trưởng đến mức tối đa.
- Hộp nuôi cấy 60 l, tuy sự lưu thông khí trong hộp chưa được điều chỉnh đồng đều, nhưng với thể tích lớn, cây không bị giới hạn về không gian để phát triển, có thể nuôi cấy nhiều cây con cùng lúc, tiết kiệm thời gian nuôi cấy và chi phí sản xuất.
- Cây húng chanh tăng trưởng nhanh chóng trong hệ thống nuôi cấy quang tự
dưỡng bơm khí trực tiếp sử dụng hộp 60 l, thời gian nuôi cấy thích hợp là 35 ngày, sau đó có thể thu hoạch cây và chuyển ra vườn ươm.
5.2. Đề nghị
- Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng hệ thống bơm khí trực tiếp trên các hộp nuôi
cấy thể tích lớn hơn, hoàn chỉnh quy trình nhân giống, thống nhất việc kiểm soát các yếu tố thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng, việc bơm khí theo thời gian nuôi cấy.
- Khảo sát mật độ nuôi cấy cây húng chanh trong hộp 60 l để cây có thể tăng
trưởng tốt, thống nhất tiêu chuẩn mẫu ban đầu để có chất lượng cây con đồng đều.
- Khảo sát sự tích lũy hợp chất thứ cấp hoặc tinh dầu của cây húng chanh theo thời gian nuôi cấy để xác định được điều kiện tối ưu cho cây húng chanh nuôi cấy quang tự dưỡng.
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
[1]. Lê Văn Hoàng, 2006. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật.
[2]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006. Công nghệ tế bào, NXB Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
[3]. Nguyễn Trí Minh, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Văn Uyển, 2008 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và hàm lượng CO2 lên khả năng sinh
trưởng in vitro và ex vitro cây dâu tây (Fragaria ananassa Duch.). Tạp
chí Công nghệ Sinh học 6(1): 233-239.
[4]. Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Như Hiến, Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Đình
Sỹ, 2009. Sự tăng trưởng của cây hông (Paulownia spp.) trong điều kiện
nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp. Báo cáo khoa học hội nghị
công nghệ sinh học toàn quốc 2009 – CNSH phục vụ nông – lâm nghiệp, thủy sản, công nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường: 323 – 326.
[5]. Nguyễn Thị Quỳnh, Hoàng Minh Tuấn, Nguyễn Như Hiến, 2009. Ảnh
hưởng của nồng độ đường, sự trao đổi khí và cường độ ánh sáng lên sự
tăng trưởng của cây húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.)
Spreng) nuôi cấy quang tự dưỡng trong bao nylon có màng trao đổi khí.
Tuyển tập Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc khu vực phía Nam 2009 : 297-301.
[6]. Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Đình Sỹ, Hoàng Văn Thắng, Huỳnh Hữu
Đức, Nguyễn Như Hiến, 2009. Vi nhân giống cây lan Dendrobium
Burana White bằng phương pháp nuôi cấy không đường. Tuyển tập Hội
nghị công nghệ sinh học toàn quốc khu vực phía Nam 2009: 216-221. [7]. Phạm Thành Thái, 2010. Khảo sát sự tăng trưởng của cây húng chanh
(Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) trong điều kiện vi nhân giống
quang tự dưỡng. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại
60
(Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.). Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên Tp HCM.
[8]. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh lý thực vật đại cương, Phần I: Dinh dưỡng. NXB Đại học Quốc gia, Tp. HCM.
[9]. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển. NXB Đại học Quốc gia, Tp. HCM.
Tài liệu nƣớc ngoài
[10]. Afreen F., Zobayed S. M. A., Kubota C. and Kozai T, 1999. Supporting