Tốc độ của quá trình lên men có thể theo dõi được bằng cách theo dõi sự thay đổi của hàm lượng đường trong dịch lên men. Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ:
- Thời kỳ đầu: Khoảng 2 ngày đầu kể từ lúc cho tế bào nấm men tiếp xúc với dịch lên men. Sự lên men rất chậm, đường lên men không đáng kể.
- Thời kỳ 2: Đây là thời kỳ lên men chính chiếm 2 – 5 ngày sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của tế bào nấm men và sự lên men sau mỗi giờ lên men tăng nhanh đáng kể và đạt trị số cực đại. - Thời kỳ cuối: Đây là giai đoạn lên men phụ, quá trình lên men rất chậm. Đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi, tạo vị cho sản phẩm.
Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men.
2.4.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men [5], [10]
Trong sản xuất ngoài việc lựa chọn chủng nấm men người ta còn phải nguyên cứu các điều kiện phù hợp nhất để đạt được hiệu suất lên men cao. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men gồm:
2.4.4.1. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng
Nấm men chỉ có khả năng lên men các đường đơn giản đặc biệt là matose saccharose. Trong dịch lên men ngoài đường ra phải bổ sung thêm một số thức ăn cần thiết cho nấm men như các muối photphat và đạm như urê. Nồng độ đường thích hợp từ 18 – 22%, nếu cao hơn thì khả năng lên men giảm và ngược lại nếu nồng độ thấp sẽ không tạo điều kiện cho quá trình lên men. Thường ở nồng độ đường 30 – 35% thì sự lên men bị đình chỉ.
2.4.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt động sống của nấm men, cụ thể là nấm men saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men nước giải khát. Lên men nước giải
khát thích ứng ở nhiệt độ 28 – 300C, ở nhiệt độ 500C trở đi và dưới 00C thì nấm men không hoạt
động. Trong thực tế người ta có thể lên men ở nhiệt độ trong khoảng 4 – 280C tùy theo yêu cầu
2.4.4.3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng
pH có ý nghĩa quan trọng trong quá trình lên men nước giải khát. Nấm men có thể phát triển trong môi trường pH từ 2 – 8 nhưng thích hợp là từ 4 – 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn, khi thấp hơn mức này chỉ có thể nấm men phát triển được, vì thế trong quá trình lên men nên điều chỉnh pH < 4. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men người ta thường bổ sung vào môi trường lên men một loại axit không gây ảnh hưởng hoạt động của nấm men. Thực tế người ta hay dùng axit citric để điều chỉnh pH.
2.4.4.4. Ảnh hƣởng của oxy
Oxy là thành phần quan trọng trong giai đoạn phát triển sinh khối của tế bào nấm men. Tuy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng sản phẩm trong các công đoạn kế tiếp. Lên men nước giải khát là một quá trình lên men yếm khí, nhưng lên men trong giai đoạn đầu nhất thiết phải cho dịch lên men tiếp xúc với oxy để cho nấm men sinh trưởng và phát triển ( tăng sinh khối). Nhưng oxy chỉ cần có ít trong giai đoạn đầu, khi dịch lên men đã đạt số lượng tế bào nấm men thì ngăn chặn dịch lên men tiếp xúc với oxy để nấm men tiến hành quá trình lên men chuyển hóa đường
thành rượu và CO2.
2.4.4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ rƣợu và CO2
Rượu và CO2 có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và khả năng lên men của nấm men. Sự
sinh trưởng của nấm men bị chậm lại khi nồng độ rượu có trong môi trường lên men là 1%, từ 4 – 6% có ảnh hưởng xấu. Đa số nấm men lên men được ở nồng độ rượu từ 12 – 14% , chỉ có một số
ít lên men ở nồng độ rượu từ 17 – 20%. Khí CO2 ức chế sự lên men nhưng việc thoát khí CO2 lại
có tác dụng cho quá trình lên men. Khi khí CO2 thoát ra sẽ làm cho môi trường lên men luôn
chuyển động kéo dài trạng thái lơ lửng của tế bào nấm men nên làm tăng quá trình lên men.
2.4.4.6. Ảnh hƣởng của số lƣợng tế bào nấm men
Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình men diễn ra tốt và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm tốt hơn. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men
chậm. Sinh khối tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ chết dần, sản phẩm sinh ra mùi vị lạ, gây phí một lượng tế bào nấm men đáng kể.
2.4.5. Các sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men [5]
Khi lên men bên cạnh các sản phẩm chính là rượu etylic và khí CO2 còn có nhiều sản phẩm
phụ khác như: axit acetic, glycerin, acetaldehyde,…
2.4.5.1. Sự tạo thành glycerin
Trong điền kiện bình thường, khi pH môi trường từ 4 – 5 thì sự lên men được giải thích bằng phương trình tổng quát sau:
C6H12O6 CH3CHO + CO2 + C3H8O3 (glycerin)
Còn pH > 7 thì tạo ra sản phẩm sản phẩm sau:
C6H12O6 CH3COOH + O2 + C3H8O3 + C2H5OH
2.4.5.2. Sự tạo thành acid hữu cơ
Trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các acid hữu cơ bao gồm: acetic, lactic, citric, pyrovic và succinic nhưng nhiều nhất là acetic và lactic, axit acetic bị mất hydro và ngưng tụ tạo thành acid succinic.
2.4.5.3. Sự tạo thành este
Cùng với sự tạo thành acid, alcol dưới tác dụng của của enzyme estease của nấm men các acid và alcol sẽ tác dụng với nhau để tạo thành những este tương ứng. Được viết dưới dạng tổng quát sau:
R1CH2OH + R2COOH R2COOCH2R1 + H2O
Ngoài ra trong quá trình lên men còn tạo ra các sản phẩm phụ khác như: aceton, diacetyl và 2,3 butanol.
2.4.6. Các vi khuẩn có hại trong quá trình lên men
Dịch lên men không chỉ là môi trường dinh dưỡng cho nấm men mà còn có các vi sinh vật. Các vi sinh vật nếu lẫn vào dịch lên men chúng sẽ biến đường thành các sản phẩm khác vì thế
pH = 4 - 5
làm giảm hiệu suất lên men rượu. Trong quá trình lên men rượu thường gặp các loại vi sinh vật sau:
2.4.6.1. Vi khuẩn lactic
Đây là vi khuẩn yếm khí chúng gồm hai loại: Lactic điển hình và lactic không điển hình. Lactic điển hình sẽ biến đường thành sản phẩm duy nhất là axit lactic.
C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 18 kcal
Vi khuẩn lactic không điển hình sẽ sử dụng đường và tạo ra axit lactic, ngoài ra còn tạo ra một lượng đáng kể alcol, axit acetic, cacbonic và aceton các sản phẩm này tạo ra không ổn định.
Lactic điển hình có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 49 – 510C, còn lactic không điển hình có nhiệt
độ tối ưu trong khoảng 37 – 380
C. 2.4.6.2. Vi khuẩn acetic [5] – 350 0 C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + 116 kcal acid gluconic. 2.4.6.3. Vi khuẩn acetic Vi khuẩn lactic
CHƢƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ
3.1.
3.1.1. Chanh dây
Nguyễn Tri Phương. Loại
3.1.2.
Bảng 3.1 Thành phần của đường saccharose Biên Hoà
Saccharose 99,8 % chất khô Đường khử (Rs) 0,03% Độ ẩm (Moist) 0,05% Hàm lượng tro 0,03% Độ màu (CV) 30ICUMSA 3.1.3.
nấm men thương mại Saccharomyces cerevisiae
bởi Công ty LD Lesaffre - Cát Tường (Safviet). Địa chỉ: 240 / 37G Nguyễn Văn Luông, phường 11, Quận 6, Tp.HCM.
3.1.4.
–
3.1.5. Acid citric
Acid citric được cung cấp bởi Công ty TNHHTM – DV Hoàng Bảo Long. Địa chỉ kios 4, 136 Tô Hiến Thành, phường 14, Quận 10, Tp.HCM.
a < 0,3%. 3.1.6. Enzyme Pectinaza [19] dịch cơm , , đ là
chế phẩm Pectinex Ultra SP-L được mua Giang (133/11 Hồ Văn Huê, quận Phú
Nhuận, Tp.HCM).
3.1.6.1. Tính chất
Chế phẩm pectinase có dạng lỏng, màu hơi nâu và một chút mùi đặc trưng của các sản phẩm lên men, hòa tan tốt trong nước ở tất cả các nồng độ, có thể gây màu đục cho dung dịch nhưng không ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sản phẩm.
3.1.6.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ của pectinase [19], [20]
Độ pH: pH có thể tác động lên enzym bằng cách gây ra những biến đổi về cấu trúc, thay đổi mức độ ion hóa của các chất, thay đổi tính chất của các amino acid hoặc các coenzym xúc tác của pectinase,... Thông thường, độ pH tối ưu cho hoạt động của pectinase thường nằm ở mức 4,5 – 5,0.
Nhiệt độ: nhiệt độ để pectinase họat động tốt nhất là 45 – 550C. Nếu nhiệt độ quá cao, phản ứng thủy phân sẽ nhanh hơn nhưng các enzyme sẽ dần dần bị vô hoạt hoặc thay đổi tính chất. Mặt khác, mùi vị và chất lượng của dịch quả có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ cao. Hầu hết
các enzyme pectinase thương mại hoạt động tốt nhất ở 450C.
Ngoài ra, sự có mặt của các chất hoạt hóa (coenzyme) và các chất ức chế cũng ảnh hưởng lớn đến hoạt độ pectinase và hiệu quả của quá trình thủy phân.
Ở nhiệt độ bảo quản 200
C, chế phẩm pectinase có thể duy trì được hoạt độ trong vòng 3 tháng, nếu thời gian dài hơn thì hoạt độ enzyme sẽ giảm 1 – 2% mỗi tháng. Khi được trữ ở 0 –
100C, hoạt độ enzyme sẽ duy trì được ít nhất 1 năm.
Hình 3.4: buồng đếm Thoma-Goriaep
3.1.7. Natri carbonat (Na2CO3)
Có dạng bột trắng, s
Na2CO3 đư
3.1.8.
trong phòng thí nghiệm:
dùng trong các công đoạn pha loãng, phối trộn, pha hóa chất, các quá trình phân tích, kiểm nghiệm,…
Nước máy từ hệ thống cấp nước thành phố: dùng để rửa nguyên liệu, vệ sinh thiết bị, dụng cụ thí nghiệm,…
3.2.
3.2.1. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào nấm men [7]
3.2.1.1. Đếm số tế bào nấm men trong 1ml nấm men thƣơng mại
Đếm số tế bào nấm men trực tiếp trên buồng đếm Thoma-Goriaep bằng kính hiển vi quang học. Buồng đếm gồm một phiến kính dày, có đục 4 rãnh chia phiến kính thành 3 khoang ngang, khoang giữa thấp hơn khoang bên 0,1 mm và được chia thành 2 khoang nhỏ nhờ một rãnh dọc. Trên mỗi khoang nhỏ có kẻ một lưới đếm. Lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớn, một ô vuông lớn được chia thành 16 ô vuông nhỏ. Buồng đếm có kèm theo lá kính đậy. Kích thước các ô vuông như sau:
Cạnh: 1/20 mm
Diện tích: 1/400 mm2
Chiều cao: 0,1 mm
Thể tích: 1/4000 mm3
3.2.1.2. Tiến hành [7]
Lấy 1g nấm men tươi huyền phù trong 100ml nước cất, hút ra 1ml hòa vào 9ml nước cất tức là đã pha loãng thêm 10 lần.
Lấy 1ml trộn với 1ml xanh methylen, sau đó cho vào buồng đếm hồng cầu. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X40, điều chỉnh để thấy rõ tế bào nấm men. Đếm tổng số lượng tế bào nấm men trong 5 ô lớn của buồng đếm hồng cầu và số lượng tế bào sống ( không bị nhuộm màu).
Tính số tế bào trong 1ml nấm men thương mại:
b a A n 10 1000 4000 Trong đó:
A: lượng tế bào trong 1ml nấm men thương mại a: số tế bào đếm được trong 5 ô lớn
10n: độ pha loãng của dung dịch b: số ô nhỏ trong 5 ô lớn (16x5 = 80)
3.2.2. Phƣơng pháp xác định lƣợng đƣờng tổng, đƣờng khử [21]
3.2.2.1. Nguyên tắc: dùng ferrycyanure oxy hóa đường khử có mặt dung dịch NaOH, thu được sản phẩm ferrocyanure. Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường kiềm khi đun nóng được sản phẩm ferrocyanure. Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường kiềm khi đun nóng với chỉ thị methylen blue, suy ra hàm lượng đường khử, từ đó tính được hàm lượng đường tổng. Phương trình phản ứng
3.2.2.2. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ: bếp điện, lưới amiăng, nồi cách thủy, erlen 100ml, 250ml, bình định mức 100ml, becher 100ml, burette 25ml, pipette 5ml, 10ml, ống đong 10ml.
CH2OH (CHOH)4 CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH
Hóa chất: K3Fe(CN)6 1%, đường glucose 0,5%, NaOH 5%; 2,5N, HCl 5%, Bromothymol blue (BB) 0,1%.
3.2.2.3. Cách tiến hành [21]
Chuẩn bị dung dịch
Cân 10 g dịch chanh dây cho vào becher 100ml. Nhỏ 3 – 4 giọt bromothymol blue và cho từ từ từng giọt NaOH 5% đến khi xuất hiện màu xanh nhạt. Lọc dung dịch qua giấy lọc và định mức lên 100ml ta được dung dịch xác định đường khử.
Hút chính xác 50ml dung dịch đường khử trên cho vào bình định mức, thêm 20ml dung dịch HCl 5%, đun cách thủy trong 30 - 45 phút. Làm nguội từ từ và trung hòa lượng acid dư bằng dung dịch NaOH 2,5N với chỉ thị bromothymol blue. Định mức lên 100ml, ta có dung dịch xác định đường tổng.
Tiến hành chuẩn độ
Hút vào erlen 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 và 2,5ml dung dịch NaOH 2,5N. Tiến hành đun
sôi và chuẩn độ ngay trên bếp lần lượt bằng dung dịch đường khử và dung dịch đường tổng từ burrete, cho từng giọt một, lắc mạnh. Điểm dừng chuẩn độ khi màu vàng chanh của dung dịch ferrycyanure biến mất trong khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanure.
Thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucose 5%.
Tính kết quả
Lƣợng đƣờng khử đƣợc xác định theo công thức sau
m V V V X k g k 100 100 5 , 0 Trong đó:
Xk : lượng đường khử (g/100g hay g/100ml)
Vg : thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ (ml)
V : thể tích bình định mức của dung dịch xác định đường khử (ml) m : lượng mẫu thí nghiệm (g hoặc ml)
Lƣợng đƣờng tổng đƣợc xác định theo công thức sau
m V V V V X t g t 50 100 100 5 , 0 1 2 Trong đó:
Xt : lượng đường tổng (g/100g hay g/100ml)
Vg : thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ (ml)
Vt : thể tích dung dịch đường tổng cho chuẩn độ (ml)
V1 : thể tích bình định mức của dung dịch xác định đường khử (ml)
V2 : thể tích bình định mức của dung dịch xác định đường tổng (ml)
m : lượng mẫu thí nghiệm (g hoặc ml)
3.2.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng acid toàn phần [8]
Hàm lượng acid toàn phần là tất cả các acid có thể định lượng được bằng dung dịch kiềm chuẩn. Những acid này chủ yếu là các acid hữu cơ như: acid malic, citric, acetic, tartric, lactic,… Vì các acid trong thực phẩm đều là acid hữu cơ (acid yếu) nên khi được trung hòa hết và hoàn toàn bằng kiềm mạnh thì bao giờ pH cũng trên 7 nên chất chỉ thị thường được sử dụng ở đây là phenolphthalein có khoảng chuyển màu ở pH 8,2, cũng có thể dùng các chỉ thị chuyển màu ở pH gần 7 như bromothymol blue.
3.2.3.1. Nguyên tắc
Chuẩn độ acid yếu bằng base mạnh với chỉ thị bromothymol blue.
3.2.3.2. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ: pippette 5ml, burette 25ml, erlen 100ml, bình định mức 100ml.
Hóa chất: dung dịch NaOH chuẩn 0,1N, chỉ thị bromothymol blue 1% trong cồn
Lấy chính xác 10g dịch chanh dây. Cho thêm một ít nước cất vào cốc và lắc đều. Sau đó cho tất cả vào bình định mức 100ml, tráng cốc thật kỹ và định mức đến vạch. Lấy chính xác 10g dịch chanh dây từ bình định mức cho vào erlen rồi cho thêm 3 - 4 giọt bromothymol blue. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh khá rõ.
3.2.3.4. Tính kết quả
Hàm lƣợng acid trong dung dịch đƣợc tính theo g/100g acid citric
Trong đó:
X : lượng acid quy về acid citric (g/100g).
K : hệ số (0,0064 gam acid citric ứng với 1 ml dung dịch NaOH 0,1N) . VNaOH : thể tích dung dịch NaOH 0,1N dùng để định phân (ml).
10: khối lượng dung dịch hút định phân (g).