Thành phần hóa học của nấm men phụ thuộc vào chủng giống, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy. Các chất khô của nấm men bao gồm các thành phần sau:
Glucide của nấm men chủ yếu là glucogen (C6H10O5)n , đây là chất dự trữ năng lượng của
tế bào. Hàm lượng của nó trong tế bào nấm men có thể từ 0 - 40% và tùy thuộc trước hết vào môi trường dinh dưỡng. Trong giai đoạn đầu của lên men nồng độ đường còn cao, nên nấm men chứa nhiều glucogen. Khi lượng đường giảm, nấm men sẽ sử dụng glucogen để duy trì sự sống. Dưới tác dụng của α-amylase, glucogen sẽ biến thành maltoza và dextrin.
Protein chứa trong nấm men rượu thường vào khoảng 35 - 40% và có đủ các acid amin
không thay thế được. Về giá trị dinh dưỡng thì protein nấm men tương đương protein động vật nhưng có giá trị hơn protein thực vật. Ở nhiệt độ thích hợp dưới tác dụng của protease có sẵn trong nấm men, protein sẽ bị biến đổi thành peptone, peptide và acid amin.
Chất khoáng chiếm từ 5 - 11%. Tuy số lượng ít nhưng đóng vai trò vô cùng quan trọng
trong hoạt động của tế bào nấm men, đặc biệt là photpho. Lưu huỳnh và sắt tham gia phản ứng oxy hóa khử. Mg cũng như S và P còn có tác dụng làm hoạt hóa phosphatase trong quá trình lên men. Ca giúp loại bỏ các chất độc thải ra khi lên men, đồng thời giúp cho tổng hợp protein.
Để đảm bảo cho sự sống, nấm men cần các vitamin B1 có trong thành phần của coenzyme
carboxylase. Vitamin B2 có ở dạng ester phosphoric, acid nicotinic có trong coenzyme… Biotin
và acid paraminobenzoic là những chất kích thích cho sự sinh trưởng của nấm men.
2.3.4. Sự sinh trƣởng và phát triển cúa nấm men [4]: 2.4.4.1. Sự sinh trƣởng của nấm men:
Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ, phospho, kali, magie…
Dinh dƣỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đường khác nhau như saccharose, maltose, lactose, glucose…
Dinh dƣỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch.
Dinh dƣỡng nitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, ure. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…
Các vitamin và chất khoáng: phospho, lưu huỳnh, magie...cần thiết cho hoạt động sống của nấm men.
Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 4 giai đoạn: pha lag (pha tiềm phát), pha logarit (pha phát triển chỉ số), pha ổn định và pha suy thoái.
–Pha lag (pha tiềm phát): giai đoạn nấm men cần phải thích nghi với môi trường mới, số
lượng tế bào nấm men không tăng hoặc tăng rất ít, giai đoạn này kéo dài nếu môi trường kém dinh dưỡng và ngắn hơn nếu môi trường giàu chất dinh dưỡng.
–Pha logarit (pha phát triển chỉ số): đây là giai đoạn tế bào nấm men tăng sinh khối theo
cấp số nhân, chất dinh dưỡng trong môi trường giảm đáng kể do được nấm men sử dụng để sinh sản và phát triển.
–Pha ổn định (pha tĩnh): số lượng tế bào nấm men sống là ổn định (số lượng tế bào sinh
sản bằng số lượng tế bào chết đi).
–Pha suy thoái (pha chết): tế bào sống giảm dần và già đi, tế bào chết tăng nhanh.
2.3.4.2. Sự sinh sản của nấm men [4]:
Đối với nấm men thuộc giống Saccharomyces có hai phương thức sinh sản. Đó là sinh sản
vô tính bằng cách nảy chồi và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi:
Nảy chồ là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện thuận lợi nấm men sinh sôi nảy nở nhanh. Khi một chồi xuất hiện các enzyme thủy phân sẽ làm phân giải polysaccharide của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ. Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm cho chồi phình to dần lên, khi đó sẽ xuất hiện một vết ngăn giữa chồi và tế bào mẹ. Khi tế bào chồi tách khỏi tế bào mẹ, ở chỗ tách ra còn giữ lại một vết sẹo của chồi, trên tế bào con cũng mang một vết sẹo. Tại vết sẹo này tế bào mẹ sẽ không bao giờ tạo ra một chồi non mới.
Thời gian cần thiết kể từ lúc chồi mới hình thành tới lúc tế bào này phát triển và bắt đầu tạo tế bào mới gọi là chu kỳ phát triển của nấm men.
Sinh sản hữu tính:
Bào tử túi được sinh ra trong các túi. Hai tế bào khác giới đứng gần nhau sẽ mọc ra hai mấu lồi. Chúng tiến lại gần nhau và tiếp nối với nhau. Chỗ tiếp nối sẽ tạo một lỗ thông và qua đó chất nguyên sinh có thể đi qua để tiến hành phối chất, nhân cũng đi qua để tiến hành phối nhân. Sau
(a) (b) (c)
Hình 2.8: (a): hình dạng tế bào nấm men nảy chồi ; (b): tiến trình sinh sản bằng nảy chồi ở nấm men ; (c): vết sẹo sau khi nảy chồi
đó nhân phân cắt thành 2, thành 4, thành 8. Mỗi nhân được bao bọc bởi các chất nguyên sinh rồi được tạo màng dày xung quanh và hình thành các bào tử túi. Tế bào dinh dưỡng biến thành túi.
2.4. Tổng quan về quá trình lên men [9]
Lên men là quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên có hai hình thức lên men là lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men nước giải khát là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men chúng sẽ
chuyển hóa đường lên men thành etanol và CO2.
2.4.1. Tác nhân lên men
Tác nhân chính của quá trình lên men nước giải khát là nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Dựa vào đặc tính của quá trình lên men mà nấm men được chia làm hai dạng chính:
- Nấm men nổi: Gây ra sự lên men nổi, lên men ở nhiệt độ cao từ 20-28oC. Quá trình lên
men nhanh tạo thành nhiều bọt, do tác dụng thoát khí CO2 nhiều nên trong thời gian lên men nấm
men nổi trên mặt hoặc lơ lửng trong dịch lên men và chỉ lắng xuống đáy thành một lớp xốp khi quá trình lên men kết thúc.
- Nấm men chìm: Quá trình lên men chậm ở nhiệt độ 5-100C, khí CO2 thoát ra ít trong quá
trình lên men, nấm men ở đáy thùng lên men.
2.4.2. Cơ chế của quá trình lên men [5], [9]
Để lên men người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà cho vào lượng nấm men là khác nhau, thường khi lên men lượng tế bào
nấm men phải đạt lớn hơn một triệu tế bào trong một ml dịch lên men. Vì diện tích bề mặt của tế bào nấm men lớn ( do số lượng tế bào nấm men lớn) nên khả năng hấp thụ các chất của tế bào nấm men là rất lớn. Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác có trong môi trường lên men đầu tiên được hấp thụ trên bề mặt nấm men, sau đó khuếch tan vào trong tế bào nấm men. Rượu
và CO2 được tạo thành theo phản ứng tổng quát sau:
C6H12O6 + 2ADP + 3H3PO4 = 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + H2O
Như vậy sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy quá trình oxy hóa khử có enzyme trong tế bào tham gia. Rượu etylic tạo thành khuếch tán ra môi trường ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất mạnh vào trong môi trường,
CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nên không lớn vì thế CO2 sinh ra trong quá trình lên men
sẽ khuếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa. Khí bão hòa CO2 sẽ
bám vào tế bào nấm men hình thành những bọt khí, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên tạo thành những túi khí lớn đến thời điểm nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột
sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ làm cho bọt khí CO2 thoát ra ngoài lúc này tế bào nấm men sẽ bị
chìm xuống, quá trình này cứ diễn ra liên tục nên tế bào nấm men chuyển từ trạng thái tĩnh sang trạng thái động làm tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường nên làm cho quá
trình trao đổi chất diễn ra nhanh, mạnh hơn như thế sẽ làm tăng quá trình lên men. Khí CO2 ức
chế quá trình lên men nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm
men.
Lên men ethanol được chia làm hai thời kỳ:
- Thời kỳ cảm ứng: Ở giai đoạn này, chất tiếp nhận hydro của enzyme alcoldehydrogenase
là acetaldehyde được tạo thành chưa đủ, do đó enzyme sẽ chuyển hydro đến cho aldehyde phosphatglycerinic. Dưới tác dụng của enzyme phosphatase, phosphatglycerin bị thuỷ phân để
- Thời kỳ tĩnh: Đến lúc này, lượng acetaldehyde là cơ chất bình thường của enzyme
alcoldehydrogenase được tạo thành đã có nhiều, nên enzyme sẽ chuyển hydro đến cho cơ chất của nó và rượu etylic được tạo thành từ đây. Glycerin chỉ được tạo nên trong thời kỳ cảm ứng nên nó sẽ chỉ là sản phẩm phụ trong môi trường acid.
Glucose Glyceraldehyde -3-phosphate Glycerin-3-phosphate Glycerin
10: Sơ
2.4.3. Động học của quá trình lên men [9], [11]
Tốc độ của quá trình lên men có thể theo dõi được bằng cách theo dõi sự thay đổi của hàm lượng đường trong dịch lên men. Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ:
- Thời kỳ đầu: Khoảng 2 ngày đầu kể từ lúc cho tế bào nấm men tiếp xúc với dịch lên men. Sự lên men rất chậm, đường lên men không đáng kể.
- Thời kỳ 2: Đây là thời kỳ lên men chính chiếm 2 – 5 ngày sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của tế bào nấm men và sự lên men sau mỗi giờ lên men tăng nhanh đáng kể và đạt trị số cực đại. - Thời kỳ cuối: Đây là giai đoạn lên men phụ, quá trình lên men rất chậm. Đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi, tạo vị cho sản phẩm.
Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men.
2.4.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men [5], [10]
Trong sản xuất ngoài việc lựa chọn chủng nấm men người ta còn phải nguyên cứu các điều kiện phù hợp nhất để đạt được hiệu suất lên men cao. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men gồm:
2.4.4.1. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng
Nấm men chỉ có khả năng lên men các đường đơn giản đặc biệt là matose saccharose. Trong dịch lên men ngoài đường ra phải bổ sung thêm một số thức ăn cần thiết cho nấm men như các muối photphat và đạm như urê. Nồng độ đường thích hợp từ 18 – 22%, nếu cao hơn thì khả năng lên men giảm và ngược lại nếu nồng độ thấp sẽ không tạo điều kiện cho quá trình lên men. Thường ở nồng độ đường 30 – 35% thì sự lên men bị đình chỉ.
2.4.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt động sống của nấm men, cụ thể là nấm men saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men nước giải khát. Lên men nước giải
khát thích ứng ở nhiệt độ 28 – 300C, ở nhiệt độ 500C trở đi và dưới 00C thì nấm men không hoạt
động. Trong thực tế người ta có thể lên men ở nhiệt độ trong khoảng 4 – 280C tùy theo yêu cầu
2.4.4.3. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng
pH có ý nghĩa quan trọng trong quá trình lên men nước giải khát. Nấm men có thể phát triển trong môi trường pH từ 2 – 8 nhưng thích hợp là từ 4 – 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn, khi thấp hơn mức này chỉ có thể nấm men phát triển được, vì thế trong quá trình lên men nên điều chỉnh pH < 4. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men người ta thường bổ sung vào môi trường lên men một loại axit không gây ảnh hưởng hoạt động của nấm men. Thực tế người ta hay dùng axit citric để điều chỉnh pH.
2.4.4.4. Ảnh hƣởng của oxy
Oxy là thành phần quan trọng trong giai đoạn phát triển sinh khối của tế bào nấm men. Tuy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng sản phẩm trong các công đoạn kế tiếp. Lên men nước giải khát là một quá trình lên men yếm khí, nhưng lên men trong giai đoạn đầu nhất thiết phải cho dịch lên men tiếp xúc với oxy để cho nấm men sinh trưởng và phát triển ( tăng sinh khối). Nhưng oxy chỉ cần có ít trong giai đoạn đầu, khi dịch lên men đã đạt số lượng tế bào nấm men thì ngăn chặn dịch lên men tiếp xúc với oxy để nấm men tiến hành quá trình lên men chuyển hóa đường
thành rượu và CO2.
2.4.4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ rƣợu và CO2
Rượu và CO2 có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và khả năng lên men của nấm men. Sự
sinh trưởng của nấm men bị chậm lại khi nồng độ rượu có trong môi trường lên men là 1%, từ 4 – 6% có ảnh hưởng xấu. Đa số nấm men lên men được ở nồng độ rượu từ 12 – 14% , chỉ có một số
ít lên men ở nồng độ rượu từ 17 – 20%. Khí CO2 ức chế sự lên men nhưng việc thoát khí CO2 lại
có tác dụng cho quá trình lên men. Khi khí CO2 thoát ra sẽ làm cho môi trường lên men luôn
chuyển động kéo dài trạng thái lơ lửng của tế bào nấm men nên làm tăng quá trình lên men.
2.4.4.6. Ảnh hƣởng của số lƣợng tế bào nấm men
Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình men diễn ra tốt và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm tốt hơn. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men
chậm. Sinh khối tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ chết dần, sản phẩm sinh ra mùi vị lạ, gây phí một lượng tế bào nấm men đáng kể.
2.4.5. Các sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men [5]
Khi lên men bên cạnh các sản phẩm chính là rượu etylic và khí CO2 còn có nhiều sản phẩm
phụ khác như: axit acetic, glycerin, acetaldehyde,…
2.4.5.1. Sự tạo thành glycerin
Trong điền kiện bình thường, khi pH môi trường từ 4 – 5 thì sự lên men được giải thích bằng phương trình tổng quát sau:
C6H12O6 CH3CHO + CO2 + C3H8O3 (glycerin)
Còn pH > 7 thì tạo ra sản phẩm sản phẩm sau:
C6H12O6 CH3COOH + O2 + C3H8O3 + C2H5OH
2.4.5.2. Sự tạo thành acid hữu cơ
Trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các acid hữu cơ bao gồm: acetic, lactic, citric, pyrovic và succinic nhưng nhiều nhất là acetic và lactic, axit acetic bị mất hydro và ngưng tụ tạo thành acid succinic.
2.4.5.3. Sự tạo thành este
Cùng với sự tạo thành acid, alcol dưới tác dụng của của enzyme estease của nấm men các acid và alcol sẽ tác dụng với nhau để tạo thành những este tương ứng. Được viết dưới dạng tổng quát sau:
R1CH2OH + R2COOH R2COOCH2R1 + H2O
Ngoài ra trong quá trình lên men còn tạo ra các sản phẩm phụ khác như: aceton, diacetyl