Xuất phát từ chức năng của gen CP trong sự xâm nhập, hoạt động của SMV ở tế bào chủ, sự lan truyền của SMV giữa các tế bào và nguyên lý của kỹ thuật RNAi, vùng bảo thủ của gen CP
B2013 đã đƣợc lựa chọn để thiết kế cấu trúc RNAi. Sử dụng phƣơng pháp so sánh các trình tự gen CP
CP từ các dòng SMV. So sánh 96 trình tự gen CP của SMV bằng BLAST trong NCBI thấy các trình tự gen CP
B
D E
C
G A
30
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CP
.
- -
A. tumefaciens. Các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp dƣơng tính với phản ứng PCR đƣợc lƣu giữ để phục vụ cho các thí nghiệm tạo cây chuyển gen.
in vitro
-
-
đƣợc cấy trên môi trƣờng tái sinh không bổ sung kháng sinh.
Tiến hành chuyển cấu trúc pK7GW-SMV-CPi vào cây thuốc lá, thông qua việc chủng vi khuẩn A. grobacterium tumefaciens mang cấu trúc RNAi-CPi vào tế bào của các mảnh lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum
C9-1 đã đƣợc cắt tổn thƣơng 4 cạnh và nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng MS1 trƣớc 2 ngày. Do giống thuốc lá C9-1 có lá nhỏ và mảnh nên việc giảm kích thƣớc mảnh lá thì khi lắc nhẹ trong dung dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thƣơng thực vật và dịch khuẩn, là một trong nhƣng biện pháp có thể làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu suất chuyển gen.
31
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các mảnh lá sau hai ngày đồng nuôi cấy trong tối đƣợc rửa khuẩn bằng kháng sinh cefotaxime 0,4g/l và đƣợc chuyển sang môi trƣờng GM có bổ sung cefotaxime 0,4g/l, kanamycin 0,05mg/l 3.2).
3.2. Các mảnh lá đƣợc ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn
A.tumefaciens (A), mảnh lá sau khi rửa khuẩn đƣợc cấy trên môi trƣờng chọn lọc (B) và các cụm chồi đƣợc tạo thành sau hai tuần nuôi
cấy trên môi trƣờng chọn lọc (C)
Với mỗi lô 30 mảnh lá/lần biến nạp,
lặp lại thí nghiệm 2 lần Đ Đ . 3.2. Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá Lô thí nghiệm Số mảnh lá Số mảnh lá cảm ứng chồi pK7GW-SMV- CPi 2 x 30 42 ĐC0 30 0 ĐC1 30 30 B C A
32
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
. Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng đƣợc thiết lập bằng cách đặt các mảnh lá thuốc lá C9-1 trực tiếp lên môi trƣờng GM và GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc. Toàn bộ 30 mảnh lá không chuyển gen đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ
.
Sau 2-3 tuần xuất hiện các cụm chồi
nhỏ (hình 3.3A). (3.3B),
các cụm chồi nhỏ đƣợc tách từ các mảnh lá và cấy lên môi trƣờng GMK50 bổ sung cefotaxime 0,4g/l, kanamycin 0,05g/l để nhân nhanh chồi (hình 3.3C).
Hình 3.3. (B), chồi màu
xanh đƣợc tách ra trên môi trƣờng chọn lọc (C) và chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trƣờng tạo rễ (D).
A B
33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- , tách các chồi nhỏ cấy chuyển sang môi trƣờng RM có bổ sung cefotaxime 0,4g/l, kanamycin 0,05g/l để tiến hành ra rễ (h
- -
3.2.
Các cây thuốc lá sau khi ra rễ trên môi trƣờng có kháng sinh chọn lọc đƣợc chuyển trực tiếp ra bầu đất. Kết quả thu đƣợc với 30 cây ra bầu đất, có 20 cây sống sót với các biểu hiện xanh tốt, mập mạp 3.2).
3.2. c RNAi mang gen CPi
9-1 Cấu trúc RNAi Số cụm chồi tạo thành Số cây sống sót Số cây ra bầu đất Số cây trồng tại nhà lƣới pK7GW-SMV- CPi 96 127 30 20 ĐC0 - - - - ĐC1 79 105 15 9 2 lần biến nạp cấu trúc pK7GW- SMV-CPi vào các mảnh lá thuốc lá (30 mảnh lá/ lần
sau các giai đoạn nuôi cấy và chọn lọc, thu đƣợc 127 cây con in vitro
sống sót trên môi trƣờng MS có bổ sung kháng sinh cefotaxime 400 mg/l và kanamycin 50 mg/l. Ở các đợt biến nạp đều thấy sau khoảng 3 tuần thì từ các mảnh lá biến nạp đa số đều mọc lên các cụm chồi ở các mép mảnh lá. Trong khi đó mẫu đối chứng âm không chuyển gen, khi đặt vào môi trƣờng có chứa kháng sinh chọn lọc, các mảnh lá cứ vàng dần, chết đi và hầu hết không thấy hiện tƣợng mọc chồi. Kết quả tạo đa chồi cho thấy các đợt biến nạp đều có tỉ
34
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lệ tạo đa chồi cao 70%. Tuy nhiên, cũng có một số mảnh lá không mọc chồi chiếm 30%. Từ các cụm chồi chúng tôi chọn 127 cây cho vào môi trƣờng ra rễ có bổ sung kháng sinh chọn lọc, trong số các cây này có một số cây không ra rễ. Kết quả chúng tôi thu đƣợc 30 cây cho ra môi trƣờng trấu : cát và cuối cùng 20 cây trồng tại nhà lƣới
3.4).
3.4. ên
Còn mẫu đối chứng ĐC1 không chuyển gen và không cấy lên môi trƣờng kháng sinh chọn lọc mà cấy lên môi trƣờng tạo đa chồi, kéo dài chồi và môi trƣờng ra rễ bình thƣờng thì thu đƣợc kết quả là hầu hết các cụm chồi đƣợc
35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
mọc lên ở các mép mảnh lá. Từ cụm chồi chúng tôi chọn 105 cây cho vào môi trƣờng ra rễ không bổ sung kháng sinh chọn lọc. Kết quả thu đƣợc 15 cây cho ra môi trƣờng trấu:cát, sau đó số cây trồng tại nhà lƣới chỉ còn lại 9 cây.
Các dòng cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lƣới đƣợc khoảng 3-4 tuần thì tiến hành thu lá để thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển.