cây invitro làm ,
mảnh lá bánh tẻ là nguyên liệu thích hợp để chuyển gen vào cây thuốc
lá. in vitro 2.1.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cây mô thực hiện trong phòng nuôi
22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cƣờng độ chiếu sáng 200x.
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro
Môi trƣờng Thành phần
MS0 MSI(20ml/l) + MSII(20ml/l) + MSIII(5ml/l) + MSIV(5ml/l) + MSV(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l)
MS1 MSI(20ml/l) + MSII(20ml/l) + MSIII(5ml/l) + MSIV(5ml/l) + MSV(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l)+ BAP(0,001g/l)
GM
MSI(20ml/l) + MSII(20ml/l) + MSIII(5ml/l) + MSIV(5ml/l) + MSV(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP(0,001g/l) + Kanamycin 0,05g/l + cefortaxime 0,4g/l
GMK50
MSI(20ml/l) + MSII(20ml/l) + MSIII(5ml/l) + MSIV(5ml/l) + MSV(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP(0,001g/l) + Kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,4g/l
RMK50
MSI(20ml/l) + MSII(20ml/l) + MSIII(5ml/l) + MSIV(5ml/l) + MSV(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l) + IBA 0,0001g/l. + Kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,4mg/l
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens
Lấy chủng khuẩn từ đĩa giữ khuẩn và cấy vạch lên môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc (Rifamycine 0,025g/l, spectinomycine 0,1g/l với chủng A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc pK7GW-SMV-CPi) nuôi trong tủ lắc 200 vòng/phút 280
C trong 48h.
Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 20ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc nhƣ khi nuôi ở môi
23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trƣờng LB đặc. Nuôi trong tủ lắc 200 280C trong 48h. Sau 2 ngày nuôi phục hồi khuẩn trong môi trƣờng không kháng sinh, bổ sung thêm 20ml LB lỏng đem nuôi lắc 200 vòng/phút 280
C trong 3 - 5h. Lấy khoảng 1,5 – 2,0 ml dịch khuẩn và môi trƣờng LB lỏng dùng để nuôi khuẩn nhƣ trên đo OD nếu OD600nm đạt 0.6 - 0.8, đủ điều kiện để biến nạp vào mảnh lá thuốc lá.
Ly tâm 5.000 rpm trong 15 phút 40C, bỏ dịch nổi, thu sinh khối lắng rồi hoà thành dịch huyền phù tế bào trong 40ml (1/2MS + 80µl AS).
Tạo nguyên liệu chuyển gen
in vitro. Sau 2-3 tuần cây con đƣợc khoảng 3-4 lá thật thì chọn lá bánh tẻ ở các cây con khỏe mạnh. Dùng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thƣơng tạo thành mảnh lá có hình vuông 1cm2 (cắt bỏ đƣờng gân giữa của lá). Lá bị tổn thƣơng đƣợc đặt cảm ứng trên môi trƣờng 150ml (MS0 + 1BAP) trong 2 ngày.
Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cây
Sau 48 giờ, 60 mẫu lá đã chuẩn bị ở trên ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có nồng độ OD600nm đạt 0,6 – 0,8 có lắc nhẹ trong thời gian 0,5 giờ. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu đƣợc đặt ngửa lên môi trƣờng đồng nuôi cấy GM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 48 giờ.
Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen
Sau thời gian đồng nuôi cấy, ngâm và lắc nhẹ các mảnh lá biến nạp trong dung dịch 1/2MS1 có bổ sung cefotaxime (0,4g/l). Thấm khô 2 mặt các mảnh lá, chuyển sang môi trƣờng GM (BAP – 0,001g/l) có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 0,05g/l, cefortaxime 0,4g/l để tái sinh.
24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình/cụm sau thời gian 4-5 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống thuốc lá. Các cụm chồi đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trƣờng GM đƣợc cắt chuyển sang môi trƣờng kéo dài chồi GMK50 có bổ sung kanamycin 0,05g/l và cefotaxime 0,4g/l.
Tạo rễ và cây hoàn chỉnh
Khi các chồi đạt chiều cao từ 2-3cm, chọn những cụm phân hóa mạnh sau đó tách những chồi độc lập cấy chuyển sang môi trƣờng ra rễ RMK50 có bổ sung kanamycin 0,05g/l và cefotaxime 0,4mg/l.
Khi cây in vitro có 3-4 lá, có bộ rễ đảm bảo (thƣờng sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây đƣợc lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây đƣợc bầu trấu - cát (1 : 1).
Cây con 4 - 5 lá thật đƣợc đƣa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lƣới.