4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA đỀ TÀI
2.1. NGUYÊN LIỆU, đỊA đIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
* động vật thắ nghiệm
Chuột nhắt trắng dòng BALB/c ựược nuôi trong ựiều kiện tiêu chuẩn của khu chăn nuôi của Viện Công nghệ sinh học.
* Dòng tế bào ung thư tủy (Myeloma)
Dòng Sp2/0-Ag14 (gọi tắt Sp2/0) và P3X-Ag18 (gọi tắt P3X) nhận từ ngân hàng tế bào ATCC, Hoa kỳ (American type Culture Collection).
2.1.2. Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu
Nghiên cứu ựược tiến hành từ tháng 10 năm 2011 ựến tháng 10 năm 2013 tại Phòng thực nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội.
2.1.3. Các thiết bị thắ nghiệm
- Tủ nuôi tế bào (Sanyo, Nhật bản) có ựiều khiển ựộ và CO2 tự ựộng. - Tủ nuôi cấy vô trùng sử dụng ựèn cực tắm và màng lọc 0,25ộm - Chai lọ nuôi cấy, pipet các loại của Costar và Corning Incorparated. - Kắnh hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật) với ựộ phóng ựại 5-20x20. - Buông ựếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ).
- Máy ựo ELISA (Thermo labsystem, đức).
2.1.4. Các hóa chất thắ nghiệm
* Môi trường nuôi cấy
- DMEM (DulbecoỖs Modifie Eagles Medium) - RPMI 1640
- HAT (Hypoxanthine aminopterin thimidine) medium= 250ml - HT (Hypoxanthine thimidine)
* Hóa chất thắ nghiệm
- PEG (Polyethylene glycol)
- FCA (Freund Complex Adjuvant) và FIA (Freund Incomlex Adjuvant)
* Các hóa chất thực hiện ELISA
- Coating buffer pH= 9,6
- Photphate buffer saline (PBS) pH= 7,3 - W- buffer: PBS + 0,05% Tween 20
- Dilution buffer: W- buffer + 1% Skim Milk
- TMB stock solution: 10mg Tetrametyl benzidin (TMB) +1ml DMSO - Substrate solution (0,1M solution citrate buffer, pH= 6,0)
Trisodium Citrate 2 Hydrate: 26,84g Citric axit H2O: 1,828g H20 vừa ựủ ựến 1000ml - TMB working solution TMB stock solution: 0,2ml Substrate solution: 20ml H2O2: 3ộl
Các hóa chất này ựều do hãng Sigma, GIBCO- BRL cung cấp, ngoài ra còn các hóa chất thông thường khác
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Gây ựáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA - Dung hợp giữa tế bào lympho B và tế bào Myeloma
- Tách dòng tế bào lai sản xuất kháng thể ựơn dòng kháng ựặc hiệu kháng nguyên roi H:1.2 của vi khuẩn Salmonella
- đánh giá ựộ nhạy của các dòng tế bào lai
- Gây báng cho chuột, cộng hợp kháng thể ựơn dòng với HRP
- Ứng dụng của kháng thể ựơn dòng ựể xác ựịnh sự có mặt của vi khuẩn
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nguyên tắc sản xuất kháng thể ựơn dòng
Phải tạo ra ựược dòng tế bào vừa có khả năng sinh kháng thể vừa có khả năng sinh sản vô hạn. để có ựược dòng tế bào này người ta lai tế bào ung thư Myeloma với tế bào sinh kháng thể, cụ thể là tế bào lympho B.
Các bước tiến hành:
* Tạo các tế bào sinh kháng thể bằng cách tiêm kháng nguyên ựể gây miễn dịch cho chuột. Chuột ựã có ựáp ứng miễn dịch ựược giết và thu lấy lách, hạch ựể thu tế bào lympho B.
* Tạo các tế bào lai: tế bào lympho B ựã ựược hoạt hóa sinh kháng thể ựược trộn với tế bào Myeloma với tỷ lệ (1:1) rồi bổ sung thêm yếu tố thúc ựẩy dung hợp PEG (Polyethylen Glycol) ựể tạo tế bào lai.
* Nuôi cấy và chọn lọc tế bào lai: chọn lọc tế bào lai bằng cách nuôi cấy trong môi trường chọn lọc HAT (Hyposanthine Aminopterin Thymidine) và HT (Hyposanthine Thymidine). Chỉ có tế bào lai tồn tại ựược và phát triển trong môi trường này, chúng sinh trưởng nhanh và sản xuất kháng thể.
* Chọn lọc và chọn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể: các tế bào lai ựược nuôi dưỡng trong môi trường HAT và HT sẽ phát triển, sản xuất kháng thể. Tuy nhiên ựây vẫn là kháng thể ựa dòng vì chúng ựược sản sinh từ nhiều dòng tế bào. Do vậy, cần phải sàng lọc, chọn tạo ra dòng tế bào lai có khả năng sinh kháng thể có tắnh ựặc hiệu cao.
Sơ ựồ 2.1. Quy trình sản xuất KTđD 2.3.2. Gây miễn dịch cho chuột
Theo phương pháp của Milstein và Kohler ựưa ra năm 1975, có cải tiến (J.Eryl Lidell and A. Cryer, 2000), [14].
Quy trình chọn lọc và tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể ựơn dòng có chất lượng cao là quy trình hết sức phức tạp, gồm nhiều giai ựoạn, do ựó cần hoàn thiện cho các giai ựoạn. Trước hết chúng tôi cần xác ựịnh lượng kháng nguyên
(Cloning) Chọn lọc tạo tiêm chủng Kháng Nguyên x Chuột nhắt trắng
Lấy tế bào lympho B Mẫn cảm kháng nguyên đại thực bào Tế bào Myeloma
Dung hợp tế bào In vitro
Quần thể tế bào lai
Một tế bào lai sinh kháng thể kháng
Dòng tế bào lai sinh KTđD
KTđD kháng kháng nguyên x Một tế bào lai sinh kháng thể kháng
Kháng nguyên roi H: 1.2 Nhân in vitro
thắch hợp với ựộng vật thắ nghiệm ựể có ựáp ứng miễn dịch tối ưu nhằm thu ựược tế bào sinh kháng thể tốt. Sau ựó là quy trình dung hợp tế bào lympho B với tế bào Myeloma. Cuối cùng là chọn dòng tế bào lai sinh kháng thể ựơndòng có chất lượng cao.
Trên cơ sơ nghiên cứu ban ựầu cho thấy, kháng nguyên roi H:1.2 do Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học cung cấp có khả năng gây ựáp ứng miễn dịch tốt trên chuột BALB/c khi kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA. Vì vậy, chúng tôi quyết ựịnh sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp này trong thắ nghiệm tạo kháng thể ựơn dòng kháng kháng nguyên roi của vi khuẩn Salmonella, 6 chuột cái BALB/c 4 tuần tuổi ựược chia làm 3 lô thắ nghiệm tương ứng như sau:
* Lô số 1: Chuột số 1 và 2 ựược tiêm kháng nguyên với liều 20 ộg/con/lần * Lô số 2: Chuột số 3 và 4 ựược tiêm kháng nguyên với liều 50 ộg/con/lần * Lô số 3: Chuột số 5 và 6 ựược tiêm kháng nguyên với liều 100 ộg/con/lần Sau 3 ngày kể từ lần tiêm cuối, tiến hành lấy máu, tách huyết thanh, sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp nhằm xác ựịnh hàm lượng kháng thể, từ ựó ựánh giá khả năng ựáp ứng miễn dịch của mỗi chuột. Giá trị OD phản ánh hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Giá trị OD thu ựược trong phản ứng ELISA càng cao chứng tỏ hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của chuột càng nhiều và ngược lại. Với 6 mẫu huyết thanh thu ựược, chúng tôi tiến hành pha loãng 1.000 lần và tiến hành thắ nghiệm với nồng ựộ 100 ộl huyết thanh trên mỗi giếng với ựộ lặp lại 3 lần. Giá trị OD thu ựược trong phản ứng ELISA của chuột ựược gây miễn dịch bằng kháng nguyên roi tái tổ hợp H:1.2.
2.3.3. Phương pháp lấy ựại thực bào
Theo phương pháp của Oliver JP. Leger và Jose. Wsaldanha, 2000 [15]. - Giết chuột, khử trùng chuột trong cồn 70Ứ
- Tiêm vào khoang bụng 3ml dung dịch PBS
- Dùng bơm tiêm hút dung dịch trong xoang bụng có chứa tế bào, ựưa vào ly tâm với tốc ựộ 1.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Lặp lại bước rửa tế bào 3 lần. Lần cuối cùng cặn tế bào ựược hòa trong 1ml DMEM có FBS 10%
- đếm tế bào, pha ựiều chỉnh sao cho dịch tế bào có mật ựộ cần thiết 10Ỡ tế bào/ml, trong môi trường DMEM 10% FBS.
2.3.4. Phương pháp ựếm tế bào
a. Chuẩn bị Trypan blue 0,4%
- Trypan blue: 0,1g
- Dung dịch sinh lý: 25ml - Màng lọc Millipore: 0,45ộm
Lấy 25ml NaCl 0,85% hòa tan 0,1g Trypan blue, cho dung dịch qua màng lọc Millipore ựược Trypan blue 0,4%.
b. đếm tế bào
Dung dịch tế bào ựược ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, hút hết dịch nổi hòa cặn vào 1ml dung dịch môi trường trypan blue 0,4%.
Dùng pipet hút 100ộl dung dịch tế bào pha với 100ộl Trypan blue. Các tế bào chết có màu xanh, tế bào sống không bắt màu. đưa dung dịch tế bào ựã trộn với Trypan blue vào buồng ựếm. Trừ những tế bào nằm trên 2 cạnh của ô vuông., ựếm tế bào sống có trong 8 ô.
Tắnh tế bào trung bình của 8 ô sẽ ựược số tế bào trung bình trong một ô. Số tế bào ựược tắnh theo WHO:
N = m ừ tb ừ V ừ 104
Trong ựó: N: Số lượng tế bào/ml
m: Số tế bào trung bình của 8 ô tb: độ pha loãng
V: Tổng thể tắch trong buồng ựếm
2.3.5. Phương pháp lấy tế bào lympho B của chuột
Theo phương pháp của Oliver JP. Leger và Jose. Wsaidanha, 2000 [15]. Giết chuột ựã ựược gây miễn dịch bằng kháng nguyên roi, khử trùng chuột bằng cồn 70Ứ. Tách lấy thùy lách và các hạch vào ựĩa petri có sẵn 10ml dung dịch PBS. Dùng kéo cắt lách và hạch thành từng mảnh nhỏ, dùng kẹp gạt nhẹ ựể các
tế bào rời nhau ra. để dung dịch lắng cặn, hút lấy dung dịch tế bào sang một ống li tâm khác, li tâm dung dịch tế bào ở tốc ựộ 1.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau ựó loại bỏ hết dịch nổi và hòa cặn tế bào trong 10ml PBS. Lặp lại thao tác này 3 lần, lần cuối cùng hòa cặn tế bào với DMEM có bổ sung 10% FBS sao cho có mật ựộ tế bào 108/ml.
2.3.6. Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp2/0 và P3X
a. Nhân nuôi và ựánh thức tế bào Sp2/0 và P3X
Chuyển ống tế bào từ trong nitơ lỏng vào cốc nước có nhiệt 36-37ỨC. Khi dung dịch bên trong ống cất ựã tan ựá hoàn toàn, lau khử trùng phắa ngoài bằng cồn 70Ứ. Chuyến dung dịch bên trong ống sang một ống li tâm, tiến hành li tâm với tốc ựộ 1.000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ lớp dung dịch nổi chứa DMSO. Hòa cặn tế bào bằng môi trường nuôi cấy rồi chuyển sang nuôi chai cho thắch hợp. Sau ựó ựể chai nuôi vào tủ ấm 37ỨC, 5%CO2.
Sau khi tế bào ựược ựánh thức thành công, phát triển bình thường, không bị nhiễm khuẩn, nhân nuôi ựể ựạt ựược lượng tế bào cần thiết 104-105 tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Trung bình 2-3 ngày môi trường phải ựược thay mới.
b. Bảo quản tế bào trong nitơ lỏng
Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trên 95%, không bị nhiễm tạp nấm, vi khuẩn. đổ bỏ môi trường cũ thay vào ựó môi trường mới, dùng pipet hút lên ựẩy xuống nhẹ nhàng cho tế bào rời ựều trong môi trường. Hút dung dịch tế bào sang ống li tâm, li tâm 1.000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ dịch nổi, hòa cặn tế bào với môi trường 10% FBS và 5% DMSO, cho dung dịch này vào trong ống cất vào lạnh -70ỨC, sau 20 giờ chuyến vào bình nitơ lỏng.
2.3.7. Dung hợp tế bào và tách dòng
Theo phương pháp của Belinda. M. Kumpel.
Hỗn dịch tế bào lympho B (nồng ựộ 106/ml) ựược ựưa vào phối hợp với tế bào Myeloma dòng Sp2/0 và P3X. Sau ựó thêm vào 1 ml PEG khuấy kỹ trong 1 phút, 5 phút sau thêm vào 3,5 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và ủ qua ựêm ở 370C, li tâm hỗn hợp tế bào, hòa cặn vào 30ml môi trường huyết thanh
có bổ sung HAT và phân phối vào các ựĩa của ựĩa nhựa Falcon 0,1ml. Sau dung hợp từ 5-7 ngày thêm vào mỗi giếng 0,1ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT, sau 10 ngày dung hợp dùng phản ứng ELISA ựể phát hiện kháng thể mong muốn ựược nhân lên trong môi trường huyết thanh. Sau 5 ngày, các giếng ựược kiểm tra và sàng lọc dòng tế bào cho kháng thể có chất lượng cao.
2.3.8. Phương pháp ELISA
- Phủ bản bằng 100ml kháng nguyên trong Coating buffer ở 4ỨC qua ựêm (nồng ựộ khoảng 125ng protein/giếng).
- Rửa bản 5 lần bằng Washing buffer
- Che chắn bản bằng 300ộl washing buffer +1% skim milk trong 1 giờ ở 37ỨC - Rửa bản 5 lần bằng washing buffer
- Bổ sung kháng thể 1 (dịch nổi của môi trường nuôi cấy) ựã pha loãng 5.000 lần bằng washing buffer + 1% sữa. đem ủ bản ở 37ỨC trong 1h.
- Rửa bản 5 lần bằng washing buffer
- đưa vào mỗi giếng 100ộl kháng thể 2 gắn enzyme peroxydase ựược pha loãng 10.000 lần trong ựệm washing buffer + 1% sữa
- đem ủ bản ở 37ỨC trong 1h
- Rửa bản 10 lần bằng washing buffer
- đưa vào mỗi giếng 100ộl dung dịch cơ chất TMB - Ủ bản ở 370C trong 10 phút
- Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 50ộl H2SO4 1N - đo OD 450 bằng ELISA reader.
2.3.9. Phương pháp cộng hợp kháng thể ựơn dòng với hoseradish peroxidase (HRP)
- Hòa tan dung dịch sodium periodate (0,3ml; 0,1 mol/l) và 5mg HRP trong 1ml nước, khuấy ựều trong 30 phút ở 4oC.
- Cho thêm 0,01M sodium acetate (pH= 4,4) ựể qua ựêm, thêm 0,5ml ethylene glycol 0,16M trong 1h ở 4oC.
- 5mg kháng thể ựơn dòng pha trong 1ml sodium carbonate (0,05M, pH 9,6) ựược bổ sung, khuấy nhẹ ở 4oC, ựể qua ựêm.
- Loại bỏ phần không gắn với enzyme bằng việc thêm 0,2ml dung dịch sodium brohydride 5mg/ml (4oC trong 3h).
- Sau ựó kết tủa bởi một thể tắch tương ựương 100% amonium sulfate (40C; 2,5h), li tâm ở 6.000rpm trong 15 phút, hòa cặn trong PBS 0,01M; pH 7,4 ở 4oC, ựể qua ựêm.
- Sau ựó bảo quản trong glycerol 500 ml/l ở 4oC (1:1)
2.3.10. Phương pháp Dot- blot
- Ngâm màng nitrocellulose trong cồn 80% trong 10 phút và ựể khô ngoài không khắ.
- Tiến hành vẽ một vòng tròn nhỏ hơn hoặc bằng 1cm tại khu vực sẽ làm Dot- blot bằng bút chì và sử dụng pipet tắp kắch thước nhỏ nhất ựể nhỏ 10ộl kháng nguyên roi H:1.2 của vi khuẩn Salmonella typhimurium ở các nồng ựộ khác nhau vào trung tâm của vòng tròn rồi ủ ở 370C trong 5 phút.
- Tiếp theo, block màng ựã phủ kháng nguyên ở trên bằng dung dịch PBS 0,01M; pH 7,4 có 5% BSA trong vòng 1h ở 37oC.
- Rửa màng bằng dung dịch PBS 0,01M; pH 7,4 ba lần, mỗi lần 10 phút. - Ủ màng bằng kháng thể ựơn dòng Sal-2-HRP 10ộl (100 ộg/ml)/dot trong 30 phút ở nhiệt ựộ phòng.
- Rửa màng bằng dung dịch PBS 0,01M; pH 7,4 ba lần, mỗi lần 10 phút. - Quan sát kết quả thu ựược và chụp ảnh.
2.2.11. Phương pháp xử lý mẫu thịt
- Nghiền mẫu và hòa mẫu trong môi trường ựệm peptone (môi trường làm giàu) theo tỉ lệ 1:10.
- Ủ 370C trong môi trường làm giàu 18-24h.
- Hút 0,5ml hỗn dịch mẫu và môi trường làm giầu vào 10 ml môi trường canh thanh chọn lọc.
- Ủ và lắc nhẹ hỗn dịch ở 42oC trong 18-24h - Hút 1ml hỗn dịch vào ống sạch.
2.3.12. Phương pháp ELISA xác ựịnh Salmonellatyphimurium trong mẫu
được thực hiện theo Liddell và Cryer (1993). Kháng thể ựa dòng kháng kháng nguyên H:1.2 của vi khuẩn Salmonella typhimurium tinh sạch từ kháng huyết thanh chuột ựược pha loãng ở nồng ựộ 8 ộg/ml trong ựệm phủ Carbonate (100 ộl/giếng), ủ bản qua ựêm ở 40C. Bản ủ ựược rửa 5 lần bằng ựệm rửa (PBS có bổ sung 0,05% Tween 20). Che chắn bản bằng 300 ộl/giếng Blocking buffer (BSA 5% pha trong PBS). Ủ bản 1 giờ ở 370C. Tiếp theo, bản ủ ựược rửa 5 lần bằng ựệm rửa. Tiếp tục bổ sung 100ộl mẫu ựã ựược xử lắ cần kiểm tra vào từng giếng. Ủ 2 giờ ở 37oC. Rửa bản 5 lần bằng ựệm rửa. Bổ sung 100ộl kháng thể ựơn dòng kháng kháng nguyên roi H:1.2 của vi khuẩn Salmonella typhimurium
gắn HRP (1:1000) ựể phát hiện sự có mặt của kháng nguyên trong mẫu. Thêm 100 ộl/giếng cơ chất TMB (3,3ỖỖ 5,5Ỗ- tetramethylbenzydene) và ủ 15 phút ở 370C. Dùng phản ứng bằng 50ộl H2SO4. đọc kết quả ELISA ở bước sóng 450nm trong vòng 15 phút.
2.3.13. Phương pháp xử lý số liệu
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. . . . đÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY đÁP ỨNG MIỄN DỊCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA
Giá trị OD phản ánh nồng ựộ kháng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Mật ựộ quang học càng nhỏ chứng tỏ lượng kháng thể ựược giữ lại càng ắt, ựiều này chứng tỏ lượng kháng thể trong huyết thanh thấp. Ngược lại, mật ựộ quang học càng lớn chứng tỏ lượng kháng thể ựược giữ lại càng nhiều và ựồng nghĩa