4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA đỀ TÀI
1.2.1. Giống vi khuẩn Salmonella
1.2.1.1. Phân loại và ựặc ựiểm chung
Salmonella là một giống vi khuẩn thuộc vi khuẩn ựường ruột
Entererobacteriaceae và mang những ựặc tắnh chung của họ. Chủng Salmonella
ựược phát hiện ựầu tiên vào năm 1885 là Salmonella cholerae suis bởi Salmon và Smith. Năm 1934, theo ựề nghị của Hội nghị Sinh vật học quốc tế, ựể kỉ niệm người ựầu tiên tìm ra vi khuẩn, tên chắnh thức của vi khuẩn này ựược ựặt là
Salmonella.
Giống vi khuẩn Salmonella gồm trên 600 chủng (type) và chia làm 35 nhóm. Vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn Gram âm, hình gậy ngắn, hai ựầu tròn, kắch thước 0,4-0,6 x 1-3ộm, không hình thành giáp mô và nha bào. Vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm thông thường, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu ựều toàn thân hoặc hơi ựậm ở hai ựầu.
Nói chung ựa số vi khuẩn Salmonella ựều có khả năng di ựộng mạnh do có từ 7 -12 roi xung quanh thân (trừ Salmonelal gallinarum pullorum gây bệnh cho gia cầm không có roi nên không có khả năng di ựộng) (Hình 7).
đa số vi khuẩn sống hoại sinh trong ựường tiêu hóa, một số sống ở ngoài tự nhiên và chỉ có một số loài gây bệnh cho người và ựộng vật. Với người, có
Salmonella gây bệnh thương hàn và
Salmonella para typhi A, B, C gây bệnh
phó thương hàn. Với gia súc, Salmonella
gây bệnh phó thương hàn cho lợn gồm
Salmonella cholerae suis chủng
Kunzendorf và Salmonella typhisuis
chủng Voldagsen; Salmonella enteritidis
gây phó thương hàn bò bê; Salmonella
gallinarum- pullorum gây bệnh ở gà,Ầ
Phần lớn Salmonella gây bệnh cho gia súc ựều có thể gây cho người chứng ngộ ựộc thức ăn như: Salmonella typhimurium, Salmonella cholerae suis,
Salmonella anatum,...
Các chủng Salmonella có chung một số epitope, nếu dùng kháng thể ựa dòng ựể phân biệt thì không ựặc hiệu và không xác ựịnh ựược các type vi khuẩn. Bởi mỗi chủng sẽ có những epitope ựặc hiệu riêng, khi dùng kháng thể ựơn dòng ựặc hiệu epitope của mỗi chủng thì kháng thể ựơn dòng sẽ chỉ liên kết với chủng có epitope. Nhờ ứng dụng của kháng thể ựơn dòng ta có thể xác ựịnh ựược chủng vi khuẩn cần nhận biết.
1.2.1.2. đặc tắnh sinh vật, hóa học
Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số ựường nhất ựịnh và không ựổi. Phần lớn các loài Salmonella có khả năng lên men sinh hơi ựường glucoz, manit, galactozẦ Một số loài lại có lên men các ựường ựó nhưng không sinh hơi. Tất cả các Salmonella ựều không lên men ựường lactoz và saccaroz.
đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải ure, không sinh indol, một số sử dụng ựược cacbon ở nguồn xitrat, phân giải xanh metylen. Các phản ứng Urease, phản ứng VP (Voges-Proskauer) âm tắnh. Các phản ứng Lysine deccacboxylase, Metyl-Red (MR), phản ứng H2S dương tắnh (Ewing- Edwards,1997).
Hình 1.7. Vi khuẩn Salmonella
(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/ Salmonella)
1.2.1.3. Sức ựề kháng
Vi khuẩn Salmonella có sức ựề kháng cao với ựiều kiện ngoại cảnh nhưng mẫn cảm với nhiệt ựộ cao và các chất sát trùng mạnh. Ở nhiệt ựộ 50ỨC
Salmonella bị diệt sau một giờ, ở nhiệt ựộ 70ỨC trong 20 phút, ở nhiệt ựộ ựun sôi
trong 5 phút. Các chất sát trùng mạnh như NaOH 3-4%, Formalin 2-5%, Ầựều có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn này có thể sống ựược ở trong thịt uớp muối (nồng ựộ muối 29%) ựược 4-8 tháng ở nhiệt ựộ 6-12ỨC.
Salmonella khó sinh sản ở trong nước thường nhưng có thể tồn tại một
tuần, trong nước ựá có thể sống 2-3 tháng. Trong xác ựộng vật chết chôn ở bùn, các vi khuẩn này có thể sống 2-3 tháng.
Trong môi trường nuôi cấy, Salmonella bị mất rất nhanh khả năng gây bệnh, vì vậy trước khi khử khả năng gây bệnh hãy kiểm tra ựộc lực cần phải cấy truyền lại trong cơ thể con vật thụ cảm.
1.2.2. Các yếu tố gây bệnh
1.2.2.1. Các yếu tố gây bệnh không phải là ựộc tố
- Yếu tố kháng nguyên O và K.
độc lực của vi khuẩn Salmonella ựược quyết bởi chất lượng, thành phần hóa học và cấu trúc của kháng nguyên O.
- Kháng nguyên H:
Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, không có vai trò quyết ựịnh yếu tố ựộc lực như kháng nguyên O nhưng lại có vai trò bảo vệ vi khuẩn giúp chúng không bị tiêu diệt trong quá trình thực bào. Kháng nguyên H còn giúp vi khuẩn nhân lên trong tế bào gan, thận, kể cả tế bào ựại thực bào.
- Yếu tố bám dắnh:
Khả năng bám dắnh của vi khuẩn Salmonella trên niêm mạc ựường tiêu hóa ựược coi là một trong những yếu tố gây bệnh. Các yếu tố bám dắnh phân bố trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, về bản chất chúng là những protein kém chịu nhiệt, có cấu trúc kiểu lông, trọng lượng phân tử từ 8.000-10.000kda. Mỗi một loài vi khuẩn ựều có khả năng sinh ra một yếu tố ựặc trưng có cấu trúc riêng tương ựồng ựể kết nối với các ựiểm khác phù hợp với nó trên tế bào của cơ thể vật chủ. Vi khuẩn có ựộc lực càng cao thì khả năng bám dắnh càng tốt, càng thuận lợi hơn so với vi khuẩn có ựộc lực thấp.
- Khả năng xâm nhập và nhân lên của vi khuẩn Salmonella:
Khả năng xâm nhập vào tế bào Eukaryote và lớp mucosa ựường ruột là ựặc tắnh của một số chủng Salmonella có ựộc lực, còn những vi khuẩn
Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào khác thường là những chủng
không có ựộc lực. Sau khi xâm nhập vào tế bào thì vi khuẩn Salmonella hình thành xuyên bào qua mặt ựối diện của tế bào và thời gian cần cho quá trình xuyên bào thực hiện xong ắt nhất là 4 giờ. Khả năng sống sót và nhân lên của vi khuẩn Salmonella trong tế bào Eukaryote tùy thuộc vào thành phần và chất lượng của các chất dinh dưỡng khác nhau có trong tế bào vật chủ.
- Khả năng kháng kháng sinh:
Việc sử dụng thường xuyên kháng sinh mà không tuân theo sự chỉ dẫn của bác sĩ ựể phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm là một trong những nguyên nhân làm tăng khả năng kháng kháng sinh của một số vi khuẩn trong ựó có
Salmonella. Từ những năm 1988-1991, tại Mỹ ựã phân lập ựược 98 chủng vi
khuẩn Salmonella từ gà tây, trứng, chim hoang dã ựã kháng lại nhóm kháng sinh quinolone (GriggD.T, HallM.C và cs., 1994 [13]).
Theo nghiên cứu của Gibb và cs. (1991), có rất nhiều chủng Salmonella
gây bệnh Salmonellosis ở người ựược phân lập ở nhiều nước có mang ựặc tắnh kháng kháng sinh. Salmonella có khả năng kháng một số kháng sinh như: Streptomycin, Tetracyclin, Sulphonamide, AmpicillinẦ
Hiện nay trên thị trường thuốc thú y Việt Nam, gần 6.000 sản phẩm ựang ựược sử dụng rộng rãi ựã và ựang tạo nên một nguy cơ gây nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc (Trần Thị Hạnh, 1999 [3]).
1.2.2.2. Các yếu tố gây bệnh là ựộc tố
Ngoài các yếu tố gây bệnh bằng cơ học như khả năng bám dắnh, xâm nhập vào tế bàoẦ, vi khuẩn Salmonella tiết ra với 3 loại ựộc tố chắnh gây bệnh mà bản chất của chúng ựều là các protein:
* Nội ựộc tố (endotoxin):
Nội ựộc tố của vi khuẩn Salmonella rất mạnh, với liều thắch hợp tiêm tĩnh mạch, vi khuẩn giết chết chuột bạch trong vòng 48 giờ với bệnh tắch ựặc trưng là
ruột non sung huyết, mảng payer phù nề, ựôi khi hoại tử. độc tố ở ruột gây ựộc thần kinh, gây hôn mê, co giật. Nội ựộc tố ựược hình thành trong tế bào vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng ựược cố ựịnh trên thành tế bào. Nội ựộc tố vi khuẩn Salmonella ựóng vai trò quan trọng trong việc gây ra những biến ựổi bệnh lý, nhất là trong giai ựoạn nhiễm trùng huyết.
* Ngoại ựộc tố (exotoxin):
Ngoại ựộc tố chỉ phát hiện ựược khi lấy vi khuẩn có ựộc tắnh cao cho vào túi colodion rồi ựặt vào ổ bụng chuột lang ựể nuôi, sau 4 ngày lấy ra, cấy truyền tiếp như vậy 5-10 lần, sau cùng ựem lọc, nước lọc này có khả năng gây bệnh cho ựộng vật thắ nghiệm. Ngoại ựộc tố chỉ hình thành trong ựiều kiện in vivo và trong nuôi cấy kỵ khắ. Ngoại ựộc tố tác ựộng vào thần kinh và ruột.
* độc tố tế bào (cytotoxin):
Có ắt nhất 3 nhóm ựộc tố tế bào do vi khuẩn Salmonella sản sinh ra và nó có ựặc tắnh quan trọng là làm tổn thương tế bào biểu mô ruột.
1.2.3. Bệnh do Salmonella gây ra
Dựa vào tắnh gây bệnh ựối với ựộng vật, vi khuẩn Salmonella ựược chia thành 4 nhóm sinh học khác nhau (Nguyễn Thị Oanh, 2003 [5]).
* Nhóm 1: Gồm các chủng Salmonella gây ở một số ựộng vật nhất ựịnh như bệnh thương hàn hay bại huyết (vi khuẩn xâm nhập và phát triển ở trong máu), trong nhiều trường hợp, vi khuẩn có tắnh kết bám tế bào, tắnh xâm nhập và tắnh nội bào hoặc ở một số khác gây bệnh phó thương hàn nhờ tắnh ựề kháng huyết thanh, tắnh sinh sản nội tế bào hệ lưới nội bì, tắnh sinh ựộc tố gây chết.
* Nhóm 2: Chủng gây bệnh thương hàn, viêm dạ dày - ruột cấp tắnh, bại huyết ở người và một số ựộng vật khác.
* Nhóm 3: Gồm các Salmonella không thuộc dạng huyết thanh nêu ở nhóm 2, không có tắnh ựặc hiệu ký chủ, nhưng gây bệnh viêm dạ dày - ruột cấp tắnh ở người và chó.
* Nhóm 4: Gồm các Salmonella trừ Salmonella choleraesuis subsp.
choleraesuis, trung tâm là Salmonella cholerasuis subsp. Arizonae, Salmonella
Hiện nay, vi khuẩn Salmonella là thủ phạm chắnh gây ngộ ựộc thực phẩm, ựặc biệt là chủng Salmonella typhimurium. Khi sử dụng sản phẩm bị nhiễm
Salmonella gây ra ngộ ựộc, các triệu chứng bắt ựầu xuất hiện sau 12- 72 giờ sau khi
tiếp xúc với mầm bệnh với các triệu chứng thường gặp bao gồm: tiêu chảy, buồn nôn, ựau thắt bụng, ựau ựầu, sốt. Một số ắt người nhiễm bệnh Salmonella sẽ có các triệu chứng như ựau khớp, rát mắt, ựau khi ựi tiểu và các triệu trứng này ựược gọi chung là hội chứng Reiter. Các triệu chứng này có thể kéo dài nhiều tháng ựến nhiều năm và có thể chuyển biến thành bệnh viêm khớp mãn tắnh.
1.2.4. Kháng nguyên roi tái tổ hợp H:1.2 của vi khuẩn Salmonella typhimurium
độc tắnh của vi khuẩn Salmonela typhimurium có trong màng bao ngoài chứa một lượng lớn lipopolysaccharides. Salmonella typhimurium gây viêm dạ dày ruột ở người và những ựộng vật có vú. Toàn bộ tế bào vi khuẩn không ựược sử dụng ựể gây ựáp ứng miễn dịch cho ựộng vật thắ nghiệm mà chỉ sử dụng kháng nguyên ựặc hiệu ựược tạo ra từ vi khuẩn Salmonella typhimurium là kháng nguyên roi tái tổ hợp. Kháng nguyên roi của vi khuẩn Salmonella typhimurium
có thể ựược dùng ựể phát hiện sự nhiễm nhân tố này bằng chẩn ựoán kháng thể. Tuy nhiên, nếu dùng toàn bộ phân tử kháng nguyên sẽ xảy ra hiện tượng phản ứng chéo với các type huyết thanh Salmonella và các loài thuộc họ Enterobacteriaceae. Vì thế, một số vùng gen mã hóa toàn bộ vùng epitope (fljB1 có 101 axit amin và fljB2 có 258 axit amin) ựược ựưa vào tế bào E. coli ựể sinh tổng hợp các kháng nguyên tái tổ hợp. Kháng nguyên roi tái tổ hợp H:1.2 của vi khuẩn Salmonella
typhimurium ựã ựược nghiên cứu và sản xuất thành công bởi nhóm tác giả Nguyễn
Thị Trung và cs. (Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam).
1.2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Salmonella
a. Trên thế giới
- Năm 1888 ở Anh, Klein ựã chẩn ựoán salmonellosis từ 200 gà ựẻ bố mẹ chết trong số 400 gà ốm.
- Minga U.M và cs., 1988 ựã dùng các phương pháp ELISA, phản ứng ngưng kết huyết thanh và nuôi cấy ựể xác ựịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella của các
ựàn gà ở Mongoro. Với bệnh thương hàn, phương pháp ELISA cho kết quả 94,8% con dương tắnh; phản ứng ngưng kết huyết thanh cho kết quả 32,5% dương tắnh.
- Bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kắnh, Manhato S. N và cs. năm 1990 ựã tiến hành kiểm tra 406 mẫu huyết thanh gà ựẻ tại 3 trung tâm lấy mẫu khác nhau ựã cho kết quả dương tắnh với Salmonella gallinagrum pullorum
là 52-67%.
- Nicolas R. A. J cullen G. A (1991) ựã tiến hành phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên chịu nhiệt Heat - Extracted (HE) và kháng nguyên Lypopolysaccride (LPS) ựể phát hiện kháng thể IgG trong máu gà nhiễm
Salmonellaenteritidis.
- Tuchili L.M. và cs. (1996) ựã sử dụng phương pháp PCR với một cặp mồi ựặc hiệu của Salmonella ựể phát hiện Salmonella trong phôi thai.
b. Trong nước
- Chẩn ựoán vi khuẩn học: dùng phẩm bệnh cấy vào môi trường tăng sinh và sau ựó là môi trương phân lập, từ ựó phân lập ựược sự có mặt của các loại vi khuẩn Salmonella gây bệnh.
- Dùng phương pháp chẩn ựoán huyết thanh học ựể phát hiện gà mắc bệnh hay gà mang vi khuẩn gây lây lan bệnh tật.
- Dùng các phản ứng sinh hóa: cấy vào thạch mềm kiểm tra di ựộng, kiểm tra phản ứng chuyển hóa ựường, kiểm tra phản ứng sinh indol, H2SẦ
- Nguyễn Thị Trung và cs. (2006) thuộc phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học tổng hợp thành công kháng nguyên roi H:1.2 vi khuẩn
Salmonella typhimurium.
Hiện nay yêu cầu ựặt ra phòng bệnh hơn chữa bệnh, vì vậy phải xác ựịnh sớm ựược sự có mặt của vi khuẩn Salmonella gây bệnh hay xác ựịnh bệnh do
Salmonella gây ra ựể từ ựó ựưa ra phương pháp phòng hay ựiều trị nhanh nhất,
hiệu quả nhất. Tiện ắch hơn cả là tạo ra một bộ sinh phẩm (kit) ựể chẩn ựoán một cách nhanh nhạy sự có mặt của vi khuẩn Salmonella sử dụng kháng thể ựơn dòng kháng lại kháng nguyên ựặc trưng.
Chương 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU