- Một số nghiên cứu sử dụng hormon tuyến giáp để duy trì tình trạng ĐTĐ thực nghiệm sau khi đã dùng liều nhỏ Alloxan hoặc sau khi cắt bỏ trên 80% tuyến tụy của động vật thí nghịêm [19].
- Gây tăng glucose huyết bằng virus: một số virus dễ gây ĐTĐ khi bị nhiễm như: virus gây viêm não, viêm cơ tim dạng D, virus gây sởi Đức, virus gây bệnh bại liệt và quai bị…[27].
- Gây tăng glucose huyết bằng thủ thuật cắt bỏ tuyến tụy: Đây là một phương pháp kinh điển và cũng được nhiều nhà khoa học sử dụng để gây ĐTĐ thực nghiệm với cơ chế loại bỏ cơ quan bài tiết insulin [27]. Ở Việt Nam, năm 1993 Phan Văn Các đã áp dụng phương pháp cắt bỏ tuyến tụy để gây ĐTĐ thực nghiệm thành công trên mèo [6].
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1. Nguyên liệu
- Cây Chóp mau Việt (Salacia cochinchinensis L.), (gồm lá, thân, rễ…) do Tiến sĩ Nguyễn Duy Thuần - Viện Dược liệu cung cấp.
- Rễ cây Chóp mau Việt đã được làm khô, xay nhỏ và được chiết bằng methanol. Thu hồi dung môi ở áp suất giảm, cắn được hòa tan vào nước được cao lỏng 1:1 dùng để nghiên cứu.
- Lá, thân, rễ khô được bảo quản trong cồn để dùng làm vi phẫu.
2.1.1.2. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng trung bình 18-22g, mua tại viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.
- Chuột sau khi được mua về nuôi 3-5 ngày trước khi làm thí nghiệm tại phòng thí nghiệm bộ môn Dược lý Trường Đại học Dược Hà Nội. Chuột được cho ăn thức ăn chuẩn do viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp và được cho uống nước đun sôi để nguội.
2.1.1.3. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm bao gồm:
- Streptozotocin bột pha tiêm của hãng MP Biomedicals, LLC, Pháp.
- Gliclazid viên nén 80mg (Glimaron) do Công ty CP Dược phẩm Trung Ương I – Pharbaco sản xuất.
- Máy đo đường huyết Sure Step cùng kít thử tương ứng, nhà sản xuất LifeScan, Inc., Milpitas, USA.
- Lồng sắt cỡ to và nhỏ.
- Nước cất, bộ bình chiết, ống đong, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, chày, cối, pipet…và các hóa chất khác cần thiết do phòng Giáo tài Trường ĐH Dược Hà Nội cung cấp.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
2.1.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi phẫu.
Đặc điểm hình thái được mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [21].
Phương pháp làm tiêu bản vi phẫu: thường được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu thực vât: dược liệu cắt lát mỏng ngâm nước javen rửa sạch với nước ngâm trong acid acetic rửa sạch bằng nước nhuộm xanh metylen rửa sạch bằng nước nhuộm đỏ son phèn rửa sạch bằng nước đặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính, soi trên kính hiển vi [25].
2.1.2.2. Phương pháp xác định độc tính cấp tính của dịch chiết nghiên cứu
Chọn chuột nhắt trắng khỏe mạnh bình thường, không phân biệt giống, chia ngẫu nhiên thành nhiều lô, mỗi lô cho uống 1 liều. Cho chuột uống với liều cao nhất có thể cho uống được, sau đó giảm dần liều, theo dõi chuột trong vòng 72 giờ, nếu không có triệu chứng ngộ độc, không chết thì chế phẩm không độc ở liều thử. Nếu chuột có biểu hiện ngộ độc ở liều thử hoặc chết cần tiếp tục nghiên cứu để xác định LD50.
2.1.2.3. Phương pháp định lượng glucose huyết
Glucose huyết của chuột thí nghiệm được đo bằng máy đo glucose huyết Sure step kèm theo kít thử tương ứng.
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng oxi hóa glucose thành acid gluconic được xúc tác bởi enzyme glucose oxidase (GOD) theo phản ứng (1):
Glucose + H2O + O2 GOD Acid gluconic + H2O2 (1) H2O2 tạo thành sẽ bị peroxidase phân huỷ và giải phóng oxy, oxy hóa O- Dianisidin để tạo thành phức chất có màu vàng nâu theo phản ứng (2).
O-Dianisidin + H2O2 Phức hợp màu vàng nâu + H2O (2)
Cường độ màu được xác định bằng phương pháp đo quang tương ứng với
lượng glucose trong máu cần định lượng.
Máu đem định lượng glucose huyết là máu tĩnh mạch toàn phần được lấy từ đuôi chuột (bỏ đi giọt máu đầu tiên).
2.1.2.4. Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng STZ.
Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm, tiêm màng bụng STZ pha trong dung môi citrat (pH: 4,5-5) với liều duy nhất 150mg/kg. Định lượng glucose huyết của chuột trước và 72h sau khi tiêm, lựa chọn những con có glucose huyết tăng cao trên 10 mmol/l để tiến hành thí nghiệm.
2.1.2.5. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết nghiên cứu.
Động vật thí nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm, sau đó gây ĐTĐ bằng STZ với liều duy nhất 150mg/kg tiêm màng bụng. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết bằng cách định lượng glucose huyết trước và sau khi cho uống thuốc 4 giờ. Song song tiến hành lô chứng (uống dung dịch pha thuốc) để so sánh.
Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của các lô nghiên cứu bằng phương pháp so sánh giá trị glucose huyết tại thời điểm trước khi uống và sau khi uống 4 giờ.
2.1.2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê với sự trợ giúp của phần mềm Microsolf Excel 2003. Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi P< 0,05 [7].
Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M±SE).
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét.
2.2.1. Đặc điểm thực vật của cây Chóp mau Việt
Là tiểu mộc đứng hay trườn; nhánh non vuông. Lá có phiến dài đến 11 cm, từ từ hẹp trên cuống, nâu đen mặt trên, đo đỏ mặt dưới lúc khô, gân phụ 6-8 cặp. Chụm trên một u; hoa 5 phân; cánh hoa vàng sáp, có sọc đỏ, cao 3-4 mm; đĩa mật; tiểu nhụy 3, vàng ngà. Phì quả tròn, rộng 1,5-3,5 cm, vàng; nạc đo đỏ; hột 1-3. Phân bố: rừng ven rừng, rừng còi: Huế, Đồng Nai, Côn Sơn.
Tên khoa học của mẫu là: Salacia cochinchinensis (L.), họ Chân danh – Celastraceae do Cử nhân Ngô Văn Trại – khoa Tài nguyên - Viện dược liệu xác định. Mẫu hiện đang được lưu tại khoa tài nguyên – Viện dược liệu.
2.2.2. Đặc điểm vi phẫu của cây
2.2.2.1. Vi phẫu lá * Phần gân chính:
+ Gân dưới lồi, gân trên hơi lồi
+ Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi một hàng tế bào hình đa giác, kích thước khá đều nhau xếp đều đặn. Tiếp đến là lớp mô mềm vỏ cấu tạo bởi các tế bào hình đa giá, hình trứng kích thước to nhỏ khác nhau, xếp xít nhau không để hở khoảng gian bào. Xen giữa mô mềm vỏ và mô mềm ruột là các bó sợi gỗ gồm từ 2 đến 4 lớp thành rất dày xếp đều nhau tạo thành 1 vòng xung quanh bó libe gỗ. Lớp libe cấp 2 gồm các tế bào hình trứng, thành mỏng, nhưng bị ép sát bởi các bó sợi gỗ và gỗ cấp 2 nên bị biến dang. Các libe cấp 2 và gỗ cấp 2 xếp theo thành tững dãy xuyên tâm. Xen lẫn gỗ cấp 2 là các sợi gỗ thành dày xếp thành dãy xuyên tâm.
* Phần phiến lá:
+ Biểu bì trên và dưới giống như gân lá, là một lớp tế bào hình đa giác, kích thước khá đều nhau xếp đều đặn. Đặc biệt là hàng tế bào mô giậu, cả trên và dưới phiến lá gồm 2 lớp tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn thẳng hàng, các tế bào này xếp vuông góc với bề mặt lá. Trong các tế bào mô giậu hình chứa rất nhiều các tinh thể canxi oxalate hình cầu gai kích thước to nhỏ khác nhau. Nằm rải rác trên chiều dài phiến lá có xuất hiện các sợi gỗ thành dày xếp thành từng đám. Cách phần gân chính không xa có một khối tế bào mô cứng .
Vi phẫu: phần gân chính lá Chóp mau Việt Vi phẫn: phần phiến lá Chóp mau Việt
2.2.2.2. Vi phẫu thân Chóp mau Việt
Ngoài cùng là lớp bần có thành hóa cutin. Tiếp đến là lớp tế bào mô mềm vỏ, gồm các tế bào hình đa giác dài, thành mỏng, gồm khoảng 8 đến 10 lớp tế bào xếp xít nhau đều đặn, theo hướng tiếp tuyến thành những vòng hướng tâm không để lộ khoảng gian bào, có hiện tượng chèn ép ở phía ngoài cùng sát lớp bần. Ngay cạnh lớp mô mềm vỏ, có các tế bào mô cứng nằm rải rác tạo thành vòng đồng tâm ngăn cách mô mềm vỏ và libe. Lớp libe gồm các tế bào đa giác thành rất mỏng nhưng bị chèn ép mạnh nên bị biến dạng. Lớp gỗ rất dày chiếm khoảng 50% diện tích bề mặt, có rất nhiều cá tế bào sợi gỗ thành rất dày xếp thành dãy xuyên tâm cùng với libe gỗ, xen lẫn có các tế bào gỗ thành mỏng, và thường tập trung gần mô mềm ruột. Mô mềm ruột gồm các tế bào hình trứng to, nhỏ khác nhau xếp gần nhau để lộ khoảng gian bào. Trong có rải rác các tinh thể canxi oxalate hình cầu gai với kích thước lớn chiếm gần hết tế bào mô mềm ruột
Vi phẫu: thân cây Chóp mau Việt
2.2.2.3. Vi phẫu rễ cây Chóp mau Việt
Mặt cắt ngang của rễ hình tròn, từ ngoài vào trong có: + Lớp bần dày, hóa cutin
+ Lớp mô mềm vỏ, gồm các tế bào đa giác, hình dạng, kích thước khác nhau, xếp xít nhau, thành rất mỏng không để lộ khoảng gian bào. Xen lẫn có các tế bào mô cứng khá to, nhân phân nhánh, thường tụ tập thành đám khoảng từ 3 tế bào mô cứng trở lên, nằm rải rác trong mô mềm vỏ, xếp gần sát lớp bần, tạo thành 1 vòng hướng tâm.
+ Các bó libe và gỗ cấp 2 xếp đều đặn thành các dãy xuyên tâm. Lớp gỗ cấp 2 rất dày chiếm khoảng 60% diện tích bề mặt rễ chóc máu.
Vi phẫu: rễ cây Chóp mau Việt
2.2.3. Độc tính cấp của dịch chiết rễ cây Chóp mau Việt trên chuột nhắt trắng [9], [23].
Chuột nhắt trắng trọng lượng 20±2 (g) được chia thành 3 lô mỗi lô 10 con
Lô 1: uống thuốc với liều cao nhất có thể cho chuột uống (59 g/kg chuột/lần x 2lần). Lô 2: uống thuốc với liều bằng 80% liều của lô 1 (47,2 g/kg chuột/lần x 2lần). Lô 3: uống thuốc với liều bằng 80% liều của lô 2 (37,8 g/kg chuột/lần x 2lần). Chuột được nhịn đói 12 giờ trước khi cho uống thuốc thử, vẫn uống nước đầy đủ, sau đó uống thuốc thử. Thể tích mỗi lần cho uống là 0,2 ml/10 g chuột. Cho chuột uống thuốc 2 lần, mỗi lần cách nhau 2h. Chuột được cho ăn trở lại 2h sau uống thuốc, cho uống nước bình thường. Theo dõi chuột liên tục trong vòng 4h đầu, số chuột chết và hoạt động của chuột trong vòng 72h. Nếu chuột chết mổ xem tổn thương đại thể và xác định LD50. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 2.1: Bảng 2.1. Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ
Lô Số chuột thực nghiệm Liều dùng (g/kg chuột) Số chuột chết trong 72 giờ Tỷ lệ chết (%) trong 72 giờ 1 10 118 1 10 2 10 94,4 0 0 3 10 75,6 0 0
Ở liều cao nhất (118g/kg chuột) có thể cho chuột uống thuốc: trong 1 giờ đầu, chuột tụ thành đám, ít hoạt động, hầu như không tiêu thụ thức ăn, ít uống nước, phản xạ với kích thích, đuôi tái. Từ giờ thứ 3 trở đi, chuột hoạt động trở lại, ăn uống tăng dần, phân, nước tiểu bình thường, lông mượt, đuôi hết tái, niêm mạc hồng hào, phản xạ tốt với kích thích. Trong vòng 72 h sau, có duy nhất 1 con chết, các con còn lại đều khỏe mạnh, ăn uống và hoạt động bình thường. Trong 7 ngày tiếp sau, 9 con chuột còn lại đều khoẻ mạnh, ăn uống và hoạt động bình thường.
Ở lô 2 (liều 94,4g/kg chuột): trong 1h đầu, chuột có tụ thành đám, giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn và nước uống, nhanh nhẹn, khoẻ mạnh hơn lô 1, không có con nào chết. Trong vòng 72 h và 7 ngày sau đó, chuột ăn uống và hoạt động bình thường, tất cả đều khỏe mạnh, không có con nào chết.
Ở lô 3 (liều 75,6g/kg chuột): trong vòng 1 giờ đầu, chuột vẫn khá khỏe mạnh, đi lại nhanh nhẹn và chuột nhanh chóng trở lại bình thường. Trong vòng 72h và 7 ngày tiếp sau đó, chuột ăn uống và hoạt động bình thường, không có con nào chết.
2.2.4. Kết quả về tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết toàn phần rễ cây Chóp mau Việt trên mô hình gây tăng glucose huyết bằng STZ (liều 150mg/kg) ở chuột nhắt trắng.
Chuột nhắt trắng sau khi nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm, chọn ngẫu nhiên 7 con chuột nhắt làm lô chứng trắng:
- Lô 1 (n=7): chứng trắng, cho uống nước.
Số chuột còn lại tiêm màng bụng STZ liều duy nhất 150mg/kg. Định lượng glucose huyết sau 72 giờ, chọn những con có glucose huyết ≥ 10 mmol/l để thử tác dụng dược lý. Chia chuột có glucose huyết ≥10 mmol/l thành các lô:
- Lô 2 (n=8): Chứng STZ, cho uống nước.
- Lô 3 (n=8): Cho dùng dịch chiết rễ toàn phần rễ cây Chóp mau Việt liều tương đương 2,88 g dược liệu khô/kg chuột (A1) (tương đương liều dùng cho người là 12g dược liệu khô/người/ngày).
- Lô 4 (n=9): Cho uống dịch chiết toàn phần rễ cây Chóp mau Việt liều tương đương 14,4 gam dược liệu khô/kg chuột (A2) (tương đương 5 lần liều dùng cho người).
- Lô 5 (n=9): Cho uống Gliclazid với liều 19,2 mg gliclazid/kg chuột (tương đương liều dùng cho người 80mg/người/ngày).
Các thuốc thử đều được pha để đảm bảo thể tích thuốc (hoặc dung môi pha thuốc) cho uống 1 lần là: 0,1 ml/10g chuột.
Tiến hành định lượng lại glucose huyết sau khi uống thuốc hoặc dung môi pha thuốc 4 giờ.
Bảng 2.2. Sự biến đổi glucose huyết theo thời gian trên mô hình chuột STZ Lô Nồng độ glucose huyết trung bình (mmol/l)
0h 4h Chứng trắng (n = 7) 8,23 ± 0,53 7,40 ± 0,80 P = 0,26* Chứng STZ ( n = 8) 12,34 ± 0,58 11,33 ± 0,79 P = 0,09* A1 (n = 8) 12,49 ± 1,32 6,28 ± 0,55 P = 0,00038 A2 (n = 9) 14,43 ± 2,04 9,19 ± 1,40 P = 0,003* Gliclazid (n = 9) 16,18 ± 1,66 10,00 ± 0,99 P = 0,00026*
(*): so với thời điểm 0h.
Như vậy trên mô hình chuột tăng glucose huyết bởi STZ, dịch chiết toàn phần rễ cây Chóp mau Việt với liều tương đương 2,88 g và 14,4 g dược liệu khô/kg chuột đều có tác dụng hạ glucose huyết sau 4h uống thuốc so với thời điểm chưa dùng thuốc (P<0,01).
Bảng 2.3. Bảng so sánh tỷ lệ % hạ glucose huyết sau 4h uống thuốc so với thời điểm 0h của 3 lô chuột
A1 A2 Gliclazid
Tỷ lệ % hạ glucose huyết 47,40 ± 3,92 35,64 ± 4,86 46,12 ± 7,07 P* (so với lô chứng
Gliclazid)
0,24 0,88
Kết quả cho thấy: với liều tương đương 2,88 g và 14,4 g dược liệu khô/kg
chuột, dịch chiết toàn phần rễ cây chóp mau Việt đều cho tác dụng hạ glucose huyết với tỷ lệ % hạ glucose huyết tương ứng là 47,40 ± 3,92 và 35,64 ± 4,86. Tỷ lệ % hạ glucose huyết sau 4h uống thuốc của các lô uống dịch chiết rễ cây Chóp mau Việt và lô uống gliclazid ở liều 19,2 mg gliclazid/kg chuột khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05).
2.2.5. Kết quả sàng lọc tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết rễ cây Chóp mau Việt trên chuột nhắt trắng gây ĐTĐ bằng STZ (liều 150mg/kg)
Chuẩn bị dịch chiết: bột rễ cây Chóp mau Việt, đem chiết bằng methanol, thu
được dịch chiết rễ cây Chóp mau Việt trong methanol. Cất thu hồi dung môi ở áp
suất giảm, cắn hòa tan bằng nước sôi thu được dịch chiết nước. Sau đó đem lắc với
các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, clorofoc (CHCl3), ethyl acetate
(EtOAc), butanol (BuOH) thu được các dịch chiết Chóp mau Việt trong 4 dung môi
trên. Cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm thu được các cắn tương ứng là:
DC/n-hexan; DC/CHCl3 ; DC/EtOAc; DC/BuOH.
Chuột nhắt trắng sau khi nuôi ổn định 3-5 ngày trong phòng thí nghiệm, chọn ngẫu nhiên 9 con làm lô chứng trắng:
