Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
3.2.1. Thời gian
Từ ngày 06/2011 ựến 4/2012
3.2.2. địa ựiểm
Thắ nghiệm ựược tiến hành tại phòng thắ nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học sau thu hoạch và Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm thuộc Viện Cơ ựiện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xác ựịnh các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô. Nội dung 2: Xác ựịnh các thông số của quá trình thủy phân dịch xylan thành ựường xylose bằng enzyme xylanase.
Nội dung 3: Xác ựịnh một số thông số công nghệ của quá trình tách chiết, làm sạch và thu hồi ựường xylose quy mô phòng thắ nghiệm.
Nội dung 4: đánh giá chất lượng ựường xylose thành phẩm và ựưa ra quy trình sản xuất xylose từ lõi ngô.
3.4. Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
3.4.1. Sơ ựồ quy trình sản xuất ựường xylose từ lõi ngô
Quy trình sản xuất ựường xylose bằng enzyme xylanase ựược thể hiện ở sơ ựồ hình 3.1. Quy trình này ựược xây dựng dựa trên quy trình sản xuất ựường FOS của Bùi Kim Thúy [3] và các quy trình sản xuất các loại ựường chức năng của Nguyễn Thị Minh Hạnh và cộng sự [1]. Quy trình dự kiến sản xuất ựường xylose bằng enzyme xylanasegồm các bước chắnh: Xử lý sơ bộ lõi ngô, xử lý lõi ngô tạo dịch xylan, thủy phân dịch chứa xylan bằng enzyme xylanase, làm sạch và thu nhận ựường xylose thành phẩm.
- Xử lý nguyên liệu sơ bộ: Lõi ngô ựược làm sạch, phơi khô, nghiền nhỏ tới kắch thước thắch hợp (0,1-0,5mm) cho quá trình thuỷ phân.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
- Xử lý nguyên liệu tạo dịch xylan: Thủy phân nguyên liệu trong các khoảng nhiệt ựộ và thời gian khác nhau ựể thu nhận dịch chứa xylan.
- Xử lý dịch sau thủy phân: Tiến hành lọc lấy phần dịch xylan và chỉnh về pH = 4 - 5, cô ựặc dịch bằng máy cô chân không, bảo quản lạnh.
- Thủy phân dịch chứa xylan bằng enzyme xylanase: Dịch xylan trước khi thủy phân bằng enzyme xylanase ựược chỉnh về pH thắch hợp. Sau ựó dùng enzyme xylanase thủy phân dịch chứa xylan ựể tạo ra ựường xylose với ựiều kiện nhiệt ựộ, thời gian, pH, tỷ lệ dịch thuỷ phân thắch hợp.
- Thu hồi dịch thủy phân: Dịch sau thủy phân ựược ly tâm loại bỏ một số tạp chất và màu ở tốc ựộ 200 vòng/phút; lọc lấy phần dịch lỏng có chứa xylose, bảo quản ở 3 - 4oC cho ựến khi tách chiết.
- Làm sạch dịch thủy phân: Dịch sau khi thủy phân, dùng than hoạt tắnh với nồng ựộ 2,5 - 3,0% ựể làm sạch, loại bỏ màu trong thời gian 30 phút, sau ựó ựem lọc bằng thiết bị lọc chân không. Dịch ựược cô ựặc về nồng ựộ ≥ 40% ựường xylose bằng máy cô chân không.
- Thu hồi ựường xylose: Dịch thủy phân sau khi ựã ựược cô ựặc về nồng ựộ ≥ 40% ựường xylose thì ựem kết tinh thu hồi xylose. Một số tinh thể ựường xylose ựược bổ xung ựể làm mồi cho quá trình kết tinh. Tinh thể ựường xylose xuất hiện với số lượng lớn sau 18 giờ kết tinh. Sau khi kết tinh, tinh thể ựường xylose ựược thu hồi bằng ly tâm, rửa sạch, sấy khô.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
Sơ ựồ 3.1. Quy trình dự kiến sản xuất ựường xylose bằng enzyme xylanase 3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xác ựịnh các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô. Nội dung 2: Xác ựịnh các thông số của quá trình thủy phân dịch xylan thành ựường xylose bằng enzyme xylanase.
Xử lý sơ bộ lõi ngô (phân loại, làm sạch, nghiền nhỏ)
Xử lý lõi ngô (ựược dịch chứa xylan) làm sạch, thu hồi
Thủy phân dịch chứa xylan bằng enzyme xylanase
Dịch thủy phân có chứa ựường xylose (làm sạch, thu hồi enzyme)
Làm sạch dịch thủy phân (lọc, ly tâm, sử dụng than
hoạt tắnh)
Thu hồi và làm sạch sản phẩm (cô ựặc dịch rửa, Kết tinh,
rửa, sấy) Lõi ngô (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm ựường xylose
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
Nội dung 3: Xác ựịnh một số thông số công nghệ của quá trình tách chiết, làm sạch và thu hồi ựường xylose quy mô phòng thắ nghiệm.
Nội dung 4: đánh giá chất lượng ựường xylose thành phẩm và ựưa ra quy trình sản xuất xylose từ lõi ngô.
3.4.2. Bố trắ các thắ nghiệm xác ựịnh các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô
3.4.2.1. Thắ nghiệm 1: Lựa chọn dung môi xử lý lõi ngô
Tiến hành xử lý nguyên liệu bằng axit và bằng nước kết hợp với nhiệt ựộ. Tiến hành xử lý nguyên liệu bằng H2SO4 0,75% với nguyên liệu ựược nghiền nhỏ (0,1-0,5mm), làm sạch. Nguyên liệu lõi ngô 20 gam ựược cho vào bình thủy tinh tam giác thể tắch V= 500 ml, bổ sung dung môi. Khuấy ựều bằng tay trước khi cho vào hấp. Dùng 3 bình cho một công thức (nhắc lại 3 lần). Cố ựịnh các thông số: thời gian thuỷ phân 70 phút, nhiệt ựộ thuỷ phân 120oC, tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1/8. Sau thủy phân (axit hay nước), tiến hành lọc lấy phần dịch và chỉnh về pH = 5 bằng Ca(OH)2 rồi tiến hành xác ựịnh hàm lượng ựường khử và ựường tổng số.
3.4.2.2. Thắ nghiệm 2: Xác ựịnh tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thắch hợp
Nguyên liệu lõi ngô ựược chuẩn bị tương tự thắ nghiệm 1. điều kiện thắ nghiệm 2 là: nhiệt ựộ xử lý ở 120oC, thời gian 70 phút. Tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ựược thay ựổi ở 5 công thức tương ứng các tỷ lệ: 1/6, 1/8, 1/10, 1/12 và 1/14.
Cách tiến hành tương tự như thắ nghiệm 1. Chỉ tiêu ựánh giá là hàm lượng ựường khử và ựường tổng số.
3.4.2.3. Thắ nghiệm 3: Xác ựịnh nhiệt ựộ thuỷ phân axit thắch hợp
Trong thắ nghiệm này, các thông số cố ựịnh là thời gian xử lý 70 phút, tỷ lệ nguyên liệu / dung môi lấy từ kết quả của thắ nghiệm 2. Thắ nghiệm 3 có
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
5 công thức khác nhau về nhiệt ựộ là: 100, 110, 120, 130, 140oC. Chỉ tiêu theo dõi là hàm lượng ựường khử và ựường tổng số.
3.4.2.4. Thắ nghiệm 4: Xác ựịnh thời gian thuỷ phân axit thắch
Trong thắ nghiệm này sử dụng các thông số tỷ lệ nguyên liệu / dung môi và nhiệt ựộ từ kết quả thắ nghiệm 2 và 3. Thắ nghiệm ựược bố trắ với 5 công thức tương ứng với thời gian xử lý là 70, 80, 90, 100, 110 phút.
3.4.3. Bố trắ thắ nghiệm xác ựịnh các thông số quá trình thủy phân dịch chứa xylan thành ựường xylose bằng enzyme xylanase
3.4.3.1. Thắ nghiệm 5: Xác ựịnh nồng ựộ enzyme xylanase thắch hợp
Thắ nghiệm ựược tiến hành với mẫu có nồng ựộ cơ chất cố ựịnh là 20g/ lắt, ựộ pH=5, bổ sung enzyme xylanase ở các nồng ựộ tương ứng là: 10 ộl, 20ộl, 30ộl, 40ộl, 50ộl, 60ộl, 70ộl enzyme cho vào 20ml dịch xylan
Các mẫu thắ nghiệm ựược ựể ở nhiệt ựộ 50oC trong vòng 10 giờ. Kết thúc phản ứng, enzyme ựược bất hoạt bằng cách ựun ở 100oC trong 10 phút. Mỗi công thức thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần với bình tam giác thể tắch 500ml (200ml dịch/ bình tam giác). Chỉ tiêu ựánh giá là hàm lượng ựường khử.
3.4.3.2. Thắ nghiệm 6: Xác ựịnh nồng ựộ cơ chất thắch hợp
Thắ nghiệm 6 ựược tiến hành với mẫu có nồng ựộ cơ chất là: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 g/lắt tương ứng với 7 công thức, pH = 5. Bổ sung enzyme xylanase ở nồng ựộ ựược biết từ thắ nghiệm 5. Nhiệt ựộ phản ứng 50oC trong vòng 10 giờ. Kết thúc phản ứng, enzyme ựược bất hoạt bằng cách ựun ở 100oC trong 10 phút. Chỉ tiêu theo dõi là sự thay ựổi hàm lượng ựường khử.
3.4.3.3. Thắ nghiệm 7: Xác ựịnh thời gian thuỷ phân enzyme thắch hợp
Thắ nghiệm 7 ựược tiến hành với mẫu có nồng ựộ cơ chất và nồng ựộ enzyme xylanase ựược xác ựịnh trong thắ nghiệm 5 và 6. điều chỉnh pH=5, nhiệt ựộ 50oC. Kết thúc phản ứng, enzyme ựược bất hoạt bằng cách ựun ở
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
100oC trong 10 phút. Thời gian phản ứng từ 2 ựến 20 giờ với bước nhảy là 2 giờ.
3.4.3.4. Thắ nghiệm 8: Xác ựịnh nhiệt ựộ thủy phân enzyme thắch hợp
Thắ nghiệm 8 ựược tiến hành các thông số về nồng ựộ cơ chất, nồng ựộ enzyme, thời gian phản ứng ựược xác ựịnh từ các thắ nghiệm 4-7. điều chỉnh pH=5. Thắ nghiệm ựược tiến hành ở dãy nhiệt ựộ trong khoảng từ 35 - 70oC.
3.4.3.5. Thắ nghiệm 9: Xác ựịnh pH cho thủy phân enzyme thắch hợp
Thắ nghiệm 9 ựược tiến hành các thông số về nồng ựộ cơ chất, nồng ựộ enzyme, thời gian và nhiệt ựộ phản ứng ựược xác ựịnh từ các thắ nghiệm 4-8. Thắ nghiệm ựược tiến hành ở các pH khác nhau trong khoảng 4 Ờ 7. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.4. Bố trắ thắ nghiệm xác ựịnh một số thông số công nghệ của quá trình tách chiết, làm sạch và thu hồi ựường xylose quy mô phòng thắ nghiệm
3.4.4.1. Thắ nghiệm 10: Xác ựịnh ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tắnh ựến hiệu quả tinh sạch dịch ựường sau thủy phân
Dịch thủy phân chứa ựường xylose ựược ly tâm loại bỏ một số tạp chất ở 200 vòng/phút, lọc lấy phần dịch, bảo quản phần dịch có chứa ựường xylose ở 3 - 4oC cho ựến khi tách chiết. để loại bỏ màu của dịch lên men và các sản phẩm phụ ựược sinh ra trong quá trình thủy phân nguyên liệu ban ựầu cũng như trong quá trình lên men, dịch lên men ựược xử lý than hoạt tắnh ở các tỷ lệ khác nhau: 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 và 4%. để giảm thiểu sự hấp phụ của xylose bởi than hoạt tắnh, quá trình ựược thực hiện ở 80oC trong 30 phút, sau ựó ựem lọc bằng thiết bị lọc chân không. Hiệu quả của quá trình tinh sạch ựược ựánh giá bằng việc ựo trên máy so màu OD dịch ựường sau khi lọc chân không tại bước sóng 620nm và ựánh giá cảm quan dịch sau khi làm sạch.
3.4.4.2. Thắ nghiệm 11: Xác ựịnh ảnh hưởng của tỷ lệ tinh thể ựường xylose bổ sung ựể làm mồi ựến quá trình kết tinh thu hồi ựường xylose
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
Dịch thủy phân sau khi ựã ựược cô ựặc về nồng ựộ 40% ựường xylose và bảo quản dịch ở ựiều kiện nhiệt ựộ 10oC. Tiến hành kết tinh ở ựiều kiện nhiệt ựộ thường, có bổ sung ethanol ở nồng ựộ thắch hợp (cố ựịnh tỷ lệ dịch ựường cô ựặc/ethanol= 1/1). Trong quá trình kết tinh bổ sung tinh thể ựường xylose với các tỷ lệ khác nhau từ 0,5% ựến 5% ựể làm mầm tinh thể cho quá trình kết tinh. Hỗn hợp ethanol và ựường xylose ựược giữ trong thời gian 18 giờ, thỉnh thoảng lắc ựể xylose kết tinh.
3.4.4.3. Thắ nghiệm 12: Xác ựịnh ảnh hưởng của nhiệt ựộ tới quá trình sấy khô ựường
Tinh thể ựường xylose xuất hiện với số lượng lớn sau 18 giờ kết tinh. Sau khi kết tinh ựường xylose ựược thu hồi bằng ly tâm, rửa sạch, sấy khô ở các nhiệt ựộ khác nhau 30, 40, 50, 60, 70, 80oC trong thời gian 80 phút. Chất lượng ựường thành phẩm thu ựược tiến hành ựánh giá cảm quan ựể tìm ra ngưỡng nhiệt ựộ phù hợp nhất.
3.5. Phương pháp phân tắch 3.5.1. Các phương pháp vật lý
3.5.1.1. Xác ựịnh nồng ựộ chất khô bằng chiết quang kế [13]
để xác ựịnh hàm lượng chất khô hoà tan tổng số trong miếng quả, lấy dịch quả (không pha nước, ựem lọc bỏ hết bã lẫn trong dịch), sau ựó dùng Brix kế ựo hàm lượng chất khô hoà tan tổng số trong dung dịch, ựược số ựo Brix ựọc (0BX ựọc), ựồng thời dùng nhiệt kế ựo và ựọc trị số nhiệt ựộ của dung dịch ựo. Hàm lượng chất khô hoà tan tổng số ựược tắnh theo công thức:
Tổng chất khô hoà tan = 0BX mẫu ựo = 0BX ựọc + hệ số hiệu chỉnh nhiệt ựộ. Nếu T0 > 20 thì dùng dấu (+); Nếu T0 < 20 thì dùng dấu (-).
3.5.1.2. Xác ựịnh ựộ ẩm theo phương pháp sấy ựến khối lượng không ựổi [13]
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
3.5.1.4. Phương pháp ựo OD
Dịch chiết thu ựược ựem lọc sạch qua giấy lọc. Bật máy ựo quang phổ ựể máy ổn ựịnh trong 10 phút. Tráng cuvet bằng nước cất. Trước khi ựo mẫu cần ựo bằng nước cất trước. Sau ựó, lấy khoảng 3ml dịch chiết của mẫu cho vào cuvet và ựo trên máy ở các bước sóng cần ựo.
3.5.2. Phương pháp phân tắch chỉ tiêu hóa học
3.5.2.1. Xác ựịnh hàm lượng ựường khử và ựường tổng số theo phương pháp axit dinotro salicylic (DNS) [13]
Phương pháp xác ựịnh hàm lượng khử với thuốc thử axit dinitro salicylic. Cường ựộ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng ựộ ựường khử trong một phạm vi nhất ựịnh. Biết ựược mật ựộ quang của dung dịch ựường khử nghiên cứu với thuốc thử DNS, dựa theo ựồ thị ựường chuẩn của xylose tinh khiết với thuốc thử này ta sẽ dễ dàng tắnh ựược hàm lượng ựường khử của mẫu cần nghiên cứu. Chuẩn 3ml thuốc thử bằng HCl 0,1 N với chỉ thị phenolphtalein hết 5 ựến 6 ml là ựược, thêm NaOH nếu cần.
- Hoá chất: Thuốc thử DNS gồm
Hỗn hợp nước cất 1416 ml 3,5 axit dinitro salicylic 10,6 g
NaOH 19,8g
Hoà tan trước 3 chất trên sau ựó thêm Muối K-Na tactrat kép 306 g Phenol (nóng chảy ở 68oC) 7,6 ml Natri metabi sunfit (Na2S2O5) 8,3 g
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
* Xác ựịnh hàm lượng ựường khử
Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4-β xylanase) có khả năng phân cắt cơ chất xylan thành các xylose và các oligoxylose có tắnh khử và có khả năng bắt màu vàng cam ựặc trưng với thuốc thử DNS khi ựun nóng.
+ Xây dựng ựồ thị ựường chuẩn xylose
Dựng ựường chuẩn D-xylose: Thành phần hỗn hợp phản ứng bao gồm 50 ộl dung dịch D-xylose trong ựệm Na-acetate ở các nồng ựộ lần lượt là 0; 2; 4; 6; 8; 10 (ộmol/ml) + 450 ộl dung dịch OSX 1% (Oat spelts xylan) + 750 ộl dịch thử DNS. đun nóng trong 5 phút, sau ựó làm lạnh và ựo ựộ hấp phụ OD ở bước sóng λ= 540 nm. Thắ nghiệm cần tiến hành ựúng thời gian, các ống nghiệm cần ựậy nắp kắn tránh thất thoát trong quá trình phản ứng và sau khi phản ứng xong tiến hành làm nguội ngay.
đường chuẩn xylose ựược dựng nhờ chương trình Microsoft Excel. Với trục tung là nồng ựộ ựường và trục hoành là mật ựộ quang (phụ lục 1). Phương trình thể hiện mối tương quan giữa D-xylose và OD540nm là:
y = 11,653x + 0,8962 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong ựó y là hàm lượng xylose trong 1 ml dịch (mg/ml), x là giá trị OD540nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9675 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là chặt chẽ.
* Dùng DNS xác ựịnh hàm lượng ựường tổng số
để xác ựịnh toàn bộ ựường trong mẫu, tiến hành thuỷ phân ựể chuyển ựường không khử thành ựường khử (chủ yếu là các disaccarit thành các monosaccarit), sau ựó xác ựịnh hàm lượng ựường khử theo phương pháp DNS. Lấy 10 ml dịch cho vào bình tam giác 50ml, bổ sung H2SO4 20% sao cho nồng ựộ axit ựạt khoảng 6,5% (19ml dịch + 0,6ml H2SO4 20%), thuỷ phân trong 2 giờ ở 100oC. Dùng NaOH trung hoà về pH = 6 (bằng giấy quỳ tắm hoặc máy ựo pH) và ựịnh mức, lọc dịch. Mục ựắch của bước này là biến
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
ựường không khử trong dung dịch thành ựường khử và thông qua phương pháp DNS ựể tìm ra hàm lượng ựường khử và từ ựó tìm ra hàm lượng ựường tổng [13].
3.5.2.2. Xác ựịnh hàm lượng ựường bằng sắc ký lỏng hiệu cao năng
Thành phần ựường có trong mẫu ựược phân tắch bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao năng sử dụng cột RPM monosaccharide (phenomenex) với dung môi là nước. Nhiệt ựộ cột ựược duy trì ở 80oC. Sử dụng glycerin làm nội