3. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN
3.2.2 Sinh sản của tế bào nấm men
Các chủng nấm men sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi. Tế bào mẹ nảy ra một hay nhiều chồi non xung quanh thân, khi chồi non lớn gần bằng chồi mẹ thì chúng tách ra khỏi tế bào mẹ thành các tế bào riêng lẻ. Ở nơi chồi con đã được tách khỏi tế bào mẹ sẽ không bao giờ tạo một chồi mới mà nó sẽ tạo thành một vết sẹo. Thời gian cần thiết kể từ lúc chồi mới hình thành tới lúc tế bào phát triển và bắt đầu tạo tế bào mới gọi là chu kỳ phát triển của tế bào nấm men. Mất khoảng hai giờ để thực hiện quá trình này.
3.3 Yêu cầu đối với nấm men rượu vang
Hương vị đặc trưng của từng loại rượu không những phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính nguyên liệu, quy trình công nghệ mà còn phụ thuộc vào chủng nấm men sử dụng. Các chủng nấm men được phân lập và sử dụng trong sản xuất cần đạt một số yêu cầu như sau:
Có khả năng lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao.
Có khả năng lên men được nhiều loại đường khác nhau.
Chịu được độ cồn và độ acid cao 10 - 20%.
Thích nghi với điều kiện không thuận lợi của môi trường, đặc biệt là chất sát trùng.
Chịu được nhiệt độ thấp 4 – 10C hoặc >35C.
Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn.
Có tính kết lắng tốt.
Tạo được rượu có hương vị thơm ngon
3.4 Nấm men dùng trong sản xuất rượu vang
Hiện nay trên thế giới người ta sản xuất rượu vang bằng hai phương pháp:
Phương pháp lên men bằng hệ vi sinh vật tự nhiên
Phương pháp lên men bằng hệ vi sinh vật thuần khiết 3.4.1 Lên men rượu vang bằng vi sinh vật tự nhiên
Lên men tự nhiên tương đối phức tạp và không đồng nhất trong các giai đoạn của quá trình lên men. Những nghiên cứu khoa học cho thấy trong hệ vi sinh vật tự nhiên dùng trong sản xuất theo phương pháp lên men tự nhiên có 76 – 90% là nấm mốc, 9 – 22% là nấm men, còn lại là xạ khuẩn và vi khuẩn
Nấm men nhọn đầu: Kloeckera apiculata là loại men dại làm giảm chất lượng của vang.
Có kích thước tương đối nhỏ, có hình oval – elip hoặc hình quả chanh, tế bào có một đầu nhỏ người ta gọi đó là nấm men hình chùy, nấm men đầu nhọn. Chúng sinh sản bằng cách nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả tới 90% tổng số men khi bắt đầu lên men. Nó có thể lên men tạo thành 6 – 7 cồn, nhưng tạo ra một acid bay hơi cũng như ester của chúng làm cho rượu có mùi tạp. Nó còn kìm hãm các loại nấm men chính trong quá trình lên men. Trong quá trình lên men rượu vang, người ta không mong muốn sự phát triển của loại nấm men này.
Pichia: là một trong những tác nhân làm hỏng vang, làm vang bị đục và các thành phần trong rượu vang bị biến đổi. Chúng phát triển trên bề mặt vang làm thay đổi thành phần và hương vị của vang. Làm cho vang có hương vị khó chịu và giảm chất lượng rõ rệt.
Zygopichia: gây đục vang sau khi chiết chai, chai không đầy có khoảng trống lớn dễ bị nhiễm Zygopichia.
Hansenula: là tác nhân mạnh mẽ tạo cho vang có các ester bay hơi (etyl acetat làm cho vang có mùi thơm riêng biệt), nó cũng làm đục vang.
Vi khuẩn và nấm mốc:
Không chỉ có trong dịch quả mà còn có trong không khí rơi vào nước quả và phát triển trong dịch lên men. Vi khuẩn này tham gia vào quá trình làm chín vang hay hoàn thiện rượu vang, là trường hợp duy nhất có lợi cho rượu vang.
Người ta thường sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên có sẵn trên nguyên liệu là trái để sản xuất rượu vang có ưu điểm:
Không cần giống vi sinh vật thuần khiết
Không đòi hỏi kỹ thuật cao, không cần đầu tư nhiều cho qui trình sản xuất.
Sản phẩm khá đặc biệt vì quá trình tích lũy hương cho sản phẩm khô ng chỉ lấy từ nguồn trái cây tự nhiên mà còn được tạo ra bởi vi sinh vật tự nhiên.
Có nhiều nơi người ta không bao giờ rửa nguyên liệu trước khi làm nát để tận dụng tối đa lượng vi sinh vật có trên vỏ. Họ dùng gần như 100% lượng nguyên liệu không cần rửa để lên men. Nhiều nơi khác họ chỉ lấy 1/2 hoặc 1/3 lượng nguyên liệu để sản xuất như một chất mang vi sinh vật tự nhiên vào quá trình lên men, còn 1/2 hay 2/3 khối lượng còn lại họ đem rửa sạch, làm nát cùng khố i lượng trên.
Tuy nhiên việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên để sản xuất rượu vang có nhược điểm là chất lượng sản phẩm thường không ổn định vì không kiểm soát được chất lượng giống ban đầu khi đưa vào để lên men, mặt khác rượu dễ bị tạp nhiễm do các giống men dại, vi khuẩn tạp nhiễm.
Do vậy, việc sử dụng giống vi sinh vật thuần khiết là điều cần thiết. Có rất nhiều loại nấm men tham gia vào quá trình lên men rượu.
3.4.2 Vi sinh vật thuần khiết trong sản xuất rượu vang
Giai đoạn quan trọng nhất trong quá trình sản xuất rượu vang là quá trình lên men. Quá trình lên men được chia làm hai giai đoạn: lên men chính và lên men phụ. Ở cả hai giai đoạn vi sinh vật đều đóng vai trò quan trọng, nhất là nấm men, nấm men tham gia trong quá trình chuyển hóa đường thành cồn. Trong sản xuất rượu vang, người ta sử dụng các chủng nấm men sau:
3.4.2.1 Saccharomyces vini
Saccharomyces vini còn gọi là Saccharomyces ellipsoideus (Lodder), phần nhiều là hình cầu, hoặc oval, có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như saccharose, glucose, galactose, maltose, fructose và 1/3 rafinose từ nhiều loại nguyên liệu khác như gạo, ngô, khoai sắn... Đối với acid hữu cơ, nấm men loại này có thể sử dụng bằng cách oxy hóa acid acetic và acid lactic, không sử dụng được acid succinic, acid malic, acid tatric và acid citric... Chúng có thể lên men lượng đường trong dịch lên men là 10 – 14 %, có khi là 16 – 18 %. Rượu tạo ra trong dịch lên men đạt 10 – 12. Nhiệt độ thích hợp là 28 -30. Saccharomyces vini rất phổ biến trong nước quả chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong dich lên men. Đa số chúng có hình oval có kích thước (3 – 8) x (5 – 12) m. Ở giai đoạn cuối quá trình lên men, S. vini dễ kết lắng và làm trong dịch quả. Ở giai đoạn này, chúng thường bị già, không chuyển đường thành cồn mà chết rất nhanh.
3.4.2.2 Saccharomyces oviformis
Có nhiệt độ lên men thích hợp từ 18 – 25C. Ở 35C, sinh sản bị ức chế, ở 40C sinh sản bị ngừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 16C sinh sản và lên men bị kéo dài. Giống thuần cũng có khả năng phát triển tốt trong môi trường nước nho và các loại quả khác, có khả năng chịu được cồn cao, đường cao, lên men cạn kiệt đường và tạo độ cồn 18. S. oviformis lên men được saccharose, glucose, maltosse, fructose và 1/3 rafinose nhưng không lên men được galactose và men nổi trên bề mặt dịch lên men tạo thành màng.
3.4.2.3 Saccharomyces uvarum
Được tách ra từ nước nho. Về hình thái S. urairum không khác với các loài khác nhưng khả năng sinh bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt cao hơn
nhiều so với các loài khác. Một số chủng của loại này có khả năng lên men đạt 12 - 13 cồn trong dịch nho lên men.
Tuy nhiên theo dõi quá trình lên men tự nhiên nhiều nơi, người ta nhận thấy rằng không chỉ có một giống nấm men hoạt động mà có nhiều giống phối hợp với nhau trong suốt quá trình lên men. Hệ nấm men trong quá trình lên men rượu vang hoạt động như sau:
Hệ nấm men trong giai đoạn đầu lên men nước nho là Kloeckera apiculata. Nấm men có dạng hình chùy chiếm ưu thế và hoạt động tích tụ được 2 – 6 cồn rồi ngưng hoạt động và chết dần. Sau đó, các nấm men rượu vang chủ yếu là Saccharomyces vini và Saccharomyces oviformis phát triển đóng vai trò chủ yếu trong quá trình lên men chính và lên men phụ. Trong các dịch quả khác, đặc biệt là nước táo thường thấy nấm men thuộc loài Schizosacchromyces acidodevoratus. Loài này phân hủy acid malic, làm giảm độ acid cho các dịch quả trong quá trình lên men. Vì vậy những nghiên cứu này đã gợi mở việc dùng nấm men thuần chủng để lên men nước quả nên phối hợp những chủng nấm men chịu được độ cồn cao để lên men tiếp theo. Như vậy mới lên men triệt để lượng đường có trong dịch lên men và cho rượu vang có độ cồn cao.
CHƢƠNG II
CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Phƣơng pháp đo độ đƣờng
1.1 Nguyên tắc
Khi đi từ môi trường (không khí) vào trong một môi trường khác (chất lỏng) tia sáng sẽ bị lệch (khúc xạ). Nếu chất lỏng là một dung dịch chất hòa tan (dung dịch đường, muối...), dựa trên độ lệch tia sáng, ta có thể tính được nồng độ của chất hòa tan. Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng chất rắn hòa tan.
Sử dụng Brix kế để đo chỉ tiêu này 1.2 Cấu tạo
Khúc xạ kế gồm chủ yếu một hệ thống lăng kính, kính quan sát và đọc, một thiết bị điều chỉnh nhiệt độ (chỉ số khúc xạ thay đổi rất nhanh với nhiệt độ). Phần lớn các khúc xạ kế đều đặt trên một đế hoặc trên một giá đỡ, một số loại cầm tay.
1.3 Phương pháp đo
Có thể sử dụng hydrometer (đo tỷ trọng của dung dịch ) hoặc refractometer (đo độ phản xạ của ánh sáng khi đi qua dung dịch) để đo chỉ tiêu này. Đơn giản nhất là dùng refractometer mặc dù vẫn có sự khác biệt về giá trị đo giữa hai dụng cụ.
1.3.1 Thiết bị và dụng cụ
Hydrometer và Refractometer (0 – 35 Brix).
Ống đong 250 ml.
Nhiệt kế.
Phễu lọc.
Beaker. 1.3.2 Hóa chất
Ít nhất là 300 ml mẫu (được lấy từ các vị trí khác nhau rồi trộn lại, đuổi hết CO2 ra khỏi mẫu).
Cồn 70% v/v (dùng để làm sạch và khô dụng cụ).
Dung dịch sucrose 20% (dung dịch chuẩn cho refractometer, tương đương 20Brix).
Giấy lau kính
1.3.3 Phương pháp tiến hành
Hydrometer
Cho mẫu (đã làm lạnh đến 20C) vào ống đong sạch và khô.
Đặt nhẹ nhàng hydrometer vào, không để cho hydrometer chạm vào thành và đáy của ống đong.
Để yên vài phút cho dụng cụ đo ổn định. Đọc kết quả.
Dùng nhiệt kế đo lại nhiệt độ của mẫu. Tính kết quả. Chú ý: làm sạch dụng cụ sau khi sử dụng.
Refeactometer
Làm sạch lăng kính bằng cồn 70o
trước khi sử dụng.
Lau khô bằng giấy lau kính.
Mỗi lần thay dung dịch kiểm tra, đều phải làm sạch và khô lăng kính.
Chỉnh refractometer vào vị trí có thể quan sát được tốt nhất.
Nhỏ nước cất vào lăng kính (tương đương 0Brix).
Nhỏ dung dịch sucrose vào lăng kính (tương đương 20Brix).
Nhỏ dung dịch cần đo vào lăng kính. Đọc kết quả.
Chú ý: không được để lẫn bọt khí vào dịch đo trong quá trình chỉnh dụng cụ và quá trình đo.
1.3.4 Đơn vị đo
Mỗi vùng sử dụng một đơn vị khác nhau để đo lượng đường. Đức, Áo, Thụy Sĩ dùng Oechslé. Pháp, Ý, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Úc, New Zealand dùng Baumé. Độ Brix (hoặc Balling) được sử dụng tại phần lớn các nước còn lại.
Cần chú ý rằng độ chính xác của phép đo phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ của mẫu chất lỏng. Do vậy cần chỉnh lý kết quả đo nếu nhiệt độ đo khác với 20C.
Lượng cồn tiềm tàng là lượng cồn có thể chuyển hóa từ lượng đường tương ứng có trong quả. Được tính theo khả năng chuyển hóa đường thành cồn: 16,83g đường/L tương đương với 1% alcohol.
Các công thức chuyển đổi: Oechslé (D – 1) x 1000
Baumé 145,0 (1 – 1)
D
với mỗi độ thấp hơn 20C cần phải trừ đi 0,05 Baumé từ kết quả đo; với mỗi độ cao hơn 20C cần phải cộng vào 0,05 Baumé cho kết quả đo.
Brix 261,3 – ( D 3 , 261 )
1 Brix 1g đường / 100g dung dịch
với mỗi độ thấp hơn 20C cần phải trừ đi 0,06 Brix từ kết quả đo; với mỗi độ cao hơn 20C cần phải cộng vào 0,06 Brix cho kết quả đo.
2. Phƣơng pháp đo độ cồn
2.1 Nguyên tắc
Nhiệt độ sôi của cồn thấp hơn so với nhiệt độ sôi của nước. Chính vì vậy có thể xác định được % v/v cồn trong mẫu bằng phương pháp chứng cất tại nhiệt độ sôi của cồn. 2.2 Phương pháp Chưng cất. Tỷ trọng. 2.2.1 Thiết bị và dụng cụ Bộ chưng cất cồn. Cồn kế. Tủ sấy. Bếp điện. Cân phân tích. Bình định mức 250 ml. Ống đong 100 ml, 250 ml. Bình hút ẩm. Erlen 500ml. 1 bình đo tỷ trọng 50ml 2.2.2 Hóa chất
Mẫu rượu vang.
Đá bọt.
2.2.3 Phương pháp tiến hành
2.2.3.1 Xác định hàm lƣợng cồn bằng phƣơng pháp tỷ trọng kế
Cho khoảng 300ml mẫu vào erlen 500ml, đuổi hết CO2 bằng thiết bị sục khí. Lấy 250 ml vang (dùng bình định mức đo) và một ít đá bọt (hoặc sỏi nhỏ, sạch) vào bình cầu đun của bộ chưng cất cồn.
Dùng nước cất tráng lại bình định mức, cho luôn nước tráng bình vào bình cầu đun.
Lắp ráp bộ chưng cất. Chú ý dùng vaselin bôi các khớp nối. Đun dung dịch vang.
Trong bình hứng có chứa 20 ml nước cất. Đầu ống ngưng tụ phải nhúng ngập trong nước. Bình hứng cần để trong nước đá, hoặc nước muối đá.
Kiểm tra độ kín của hệ chưng cất. Để lưới amiăng dưới bình cầu.
Chưng cất cho đến khi hết cồn (thể tích dịch trong bình hứng khoảng 200 ml). Lấy dung dịch trong bình hứng ra. Dùng nước cất rủa đầu ống sinh hàn. Chuyển dịch cất vào bình định mức 250 ml. Định mức dung dịch đến vạch định mức.
Bình tỷ trọng được chuẩn bị trước: sạch và khô. Cân bình bằng cân phân tích.
Cho nước cất vào bình tỷ trọng vừa mới cân cho đầy miệng bình. Đậy nắp lại.
Ngâm trong nước đá để dung dịch đạt 20C. Dùng vải mềm lau bình cho thật khô. Cân trên cân phân tích.
Lấy dung dịch trong bình định mức 250 ml, tráng bình tỷ trọng vài lần bằng dung dịch cần đo, cho dung dịch vào bình tỷ trong vừa mới cân, cho đầy miệng bình. Đậy nắp lại ngâm trong nước đá để dung dịch đạt khoảng 20C. Dùng vải mềm lau bình cho thật khô. Cân trên cân phân tích.
Tính kết quả:
Khối lượng riêng của dịch sau khi chưng cất ở 20C d= m m m m 1 2
m1: khối lượng bình tỷ trọng có chứa nước cất (g) m2: khối lượng bình tỷ trọng có chưa dung dịch (g).
2.2.3.2 Xác định hàm lƣợng cồn bằng phƣơng pháp cồn kế
Xác định hàm lượng cồn trong rượu vang từ dịch chưng cất
Dịch chưng cất sau khi đo bằng phương pháp tỷ trọng kế lại được đưa vào tủ lạnh để có nhiệt độ 20C.
Lấy ra đổ vào ống đong 100 ml, chờ 1 phút, thả nhẹ nhàng cồn kế vào giữa khối dung dịch, chờ cồn kế đứng yên đọc kết quả.
Xác định hàm lượng cồn trong vang trực tiếp:
Lấy vang cho vào erlen 500ml. Dùng máy sục khí đuổi hết CO2 có trong vang.
Đưa vào tủ lạnh để có nhiệt độ 20C.
Lấy ra, đổ vào ống đong 250 ml, chờ một phút, thả nhẹ cồn kế vào giữa khối dung dịch, chờ cồn kế đứng yên, đọc kết quả.
3. Phƣơng pháp giữ giống trong ống thạch nghiêng
Giữ giống trong ống thạch nghiêng môi trường Hansen
Công thức:
Saccharose hoặc Maltose: 50g
Pepton: 10g
KH2PO4: 3g
MgSO4: 3 – 5g
Agar: 20g
Nước cất: 1000ml
Cách pha chế môi trường Hansen:
Cân chính xác và cho các thành phần của môi trường vào trong cốc chứa sẵn một ít nước.
Khuấy cho tan hết và thêm lượng nước theo yêu cầu
Đun lên cho tan hoàn toàn
Để nguội và lắng dung dịch vừa đun
Lọc bằng vải hay giấy lọc
Phân phối môi trường vào ống nghiệm đem khử trùng Phương pháp giữ giống: