3. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN
3.1 Tìm hiểu chung về nấm men
Nấm men thuộc loại vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động, đa số sinh sản theo lối nảy chồi. Trong tự nhiên, nấm men phân bố rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, có thể nói đất là môi trườn g tự nhiên để giữ giống nấm men và đặc biệt trên bề mặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại lương thực, thực phẩm khác. Đặc biệt chúng có nhiều trong đất trồng nho, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang.
Nhiều loại nấm men có khả năng lên men rượu, sinh khí CO2, có khả năng sinh sản nhanh chóng, tế bào chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thế, hàm lượng protein chứa đến 50% trọng lượng khô của tế bào, nên nhiều loại nấm men còn được sử dụng để sản xuất protein và con người cũng sử dụng nấm men để làm rượu, bia, làm bánh mì, sản xuất nước chấm... Tuy nhiên cũng có một số loài nấm men gây bệnh cho con người và gia súc như Candida, làm hư hỏng thực phẩm như
3.2 Đặc điểm của nấm men trong sản xuất rượu vang
3.2.1 Cấu tạo, hình dạng và kích thước tế bào nấm men 3.2.1.1 Cấu tạo tế bào nấm men
Nấm men có cấu tạo đơn bào gồm thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất, nhân và các cơ quan con khác.
Thành tế bào: được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau, gồm glucan, manan, protein, lipit và một số thành phần nhỏ khác như kitin. Phức hợp protein – manan rất bền vững do tế bào nấm men rất khó bị phá vỡ, thường thì các polysaccharide nằm ở phía ngoài và protit nằm phía trong gần bào tương. Kitin thường nằm ở phần nảy chồi, rất bền vững không bị enzyme phá hủy, tác dụng bảo vệ chồi trong khi chồi còn non.
Màng nguyên sinh chất: bao gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzyme permease. Trong thời kỳ tế bào còn non, màng nguyên sinh chất bám chắc vào thành tế bào, giúp cho khả năng trao đổi chất rất mạnh. Ngược lại ở thời kỳ tế bào già, màng nguyên sinh chất co lại, khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn.
Chất nguyên sinh chủ yếu được cấu tạo từ nước, protit, gluxit, lipit, các muối khoáng, enzyme, và các cơ quan con. Tế bào chất luôn chuyển động theo một chiều xung quanh thành tế bào, chúng phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của nấm men.
Nhân tế bào: khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật. Nhân hình bầu dục hay hình cầu, được bao bọc bởi một lớp màng, bên trong là dịch nhân có chứa một thể rắn gọi là hạch nhân hay nhân con. Nhân nấm men chứa protein và acid nucleic, ở trạng thái lên men nhân tăng 20 – 30 lần so với trạng thái hô hấp.
Volutin: chỉ xuất hiện ở điều kiện đặc biệt khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydrocarbon và phosphat vô cơ. Vai trò của volutin là chất dự trữ các chất dinh dưỡng cho tế bào, tham gia vào việc sinh trưởng và phát triển của tế bào, và là nguồn năng lượng cho tế bào.
Ribosome: khác với vi khuẩn (giống nấm mốc, tảo, nguuyên sinh động vật), ribosome của nấm men tồn tại hai loại:
Loại 80S: tồn tại tự do
Loại 70S: liên kết với cấu trúc màng
Ở một số nấm men, đặc biệt là nấm men có khả năng lên men rượu, vỏ tế bào có khả năng kết dính với nhau và lắng xuống đáy. Các chủng này được sử dụng trong công nghệ sản xuất bia và rượu vì lắng cặn nhanh và cho dịch lên men trong.
3.2.1.2 Hình dạng nấm men
Hình dạng tế bào nấm men không ổn định, phụ thuộc vào tuổi nấm men và điều kiên nuôi cấy ... Tế bào nấm men có hình ellip, hình cầu, hình trứng, hình oval, hình lục giác và một số hình dạng khác. Trong đó, Saccharomyces thường có hình bầu dục trong môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng, hình tròn và hình oval trong điều kiện kị khí.
3.2.1.3 Kích thước tế bào nấm men
Kích thước trung bình của tế bào nấm men từ (3 – 5) x (5 – 10) m. Ngoài ra những nang bào tử của nấm men có, dạng hình cầu với kích thước từ 2 – 4 m.
Kích thước tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện môi trường nuôi cấy và theo tuổi sinh lý.
3.2.2 Sinh sản của tế bào nấm men
Các chủng nấm men sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi. Tế bào mẹ nảy ra một hay nhiều chồi non xung quanh thân, khi chồi non lớn gần bằng chồi mẹ thì chúng tách ra khỏi tế bào mẹ thành các tế bào riêng lẻ. Ở nơi chồi con đã được tách khỏi tế bào mẹ sẽ không bao giờ tạo một chồi mới mà nó sẽ tạo thành một vết sẹo. Thời gian cần thiết kể từ lúc chồi mới hình thành tới lúc tế bào phát triển và bắt đầu tạo tế bào mới gọi là chu kỳ phát triển của tế bào nấm men. Mất khoảng hai giờ để thực hiện quá trình này.
3.3 Yêu cầu đối với nấm men rượu vang
Hương vị đặc trưng của từng loại rượu không những phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính nguyên liệu, quy trình công nghệ mà còn phụ thuộc vào chủng nấm men sử dụng. Các chủng nấm men được phân lập và sử dụng trong sản xuất cần đạt một số yêu cầu như sau:
Có khả năng lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao.
Có khả năng lên men được nhiều loại đường khác nhau.
Chịu được độ cồn và độ acid cao 10 - 20%.
Thích nghi với điều kiện không thuận lợi của môi trường, đặc biệt là chất sát trùng.
Chịu được nhiệt độ thấp 4 – 10C hoặc >35C.
Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn.
Có tính kết lắng tốt.
Tạo được rượu có hương vị thơm ngon
3.4 Nấm men dùng trong sản xuất rượu vang
Hiện nay trên thế giới người ta sản xuất rượu vang bằng hai phương pháp:
Phương pháp lên men bằng hệ vi sinh vật tự nhiên
Phương pháp lên men bằng hệ vi sinh vật thuần khiết 3.4.1 Lên men rượu vang bằng vi sinh vật tự nhiên
Lên men tự nhiên tương đối phức tạp và không đồng nhất trong các giai đoạn của quá trình lên men. Những nghiên cứu khoa học cho thấy trong hệ vi sinh vật tự nhiên dùng trong sản xuất theo phương pháp lên men tự nhiên có 76 – 90% là nấm mốc, 9 – 22% là nấm men, còn lại là xạ khuẩn và vi khuẩn
Nấm men nhọn đầu: Kloeckera apiculata là loại men dại làm giảm chất lượng của vang.
Có kích thước tương đối nhỏ, có hình oval – elip hoặc hình quả chanh, tế bào có một đầu nhỏ người ta gọi đó là nấm men hình chùy, nấm men đầu nhọn. Chúng sinh sản bằng cách nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả tới 90% tổng số men khi bắt đầu lên men. Nó có thể lên men tạo thành 6 – 7 cồn, nhưng tạo ra một acid bay hơi cũng như ester của chúng làm cho rượu có mùi tạp. Nó còn kìm hãm các loại nấm men chính trong quá trình lên men. Trong quá trình lên men rượu vang, người ta không mong muốn sự phát triển của loại nấm men này.
Pichia: là một trong những tác nhân làm hỏng vang, làm vang bị đục và các thành phần trong rượu vang bị biến đổi. Chúng phát triển trên bề mặt vang làm thay đổi thành phần và hương vị của vang. Làm cho vang có hương vị khó chịu và giảm chất lượng rõ rệt.
Zygopichia: gây đục vang sau khi chiết chai, chai không đầy có khoảng trống lớn dễ bị nhiễm Zygopichia.
Hansenula: là tác nhân mạnh mẽ tạo cho vang có các ester bay hơi (etyl acetat làm cho vang có mùi thơm riêng biệt), nó cũng làm đục vang.
Vi khuẩn và nấm mốc:
Không chỉ có trong dịch quả mà còn có trong không khí rơi vào nước quả và phát triển trong dịch lên men. Vi khuẩn này tham gia vào quá trình làm chín vang hay hoàn thiện rượu vang, là trường hợp duy nhất có lợi cho rượu vang.
Người ta thường sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên có sẵn trên nguyên liệu là trái để sản xuất rượu vang có ưu điểm:
Không cần giống vi sinh vật thuần khiết
Không đòi hỏi kỹ thuật cao, không cần đầu tư nhiều cho qui trình sản xuất.
Sản phẩm khá đặc biệt vì quá trình tích lũy hương cho sản phẩm khô ng chỉ lấy từ nguồn trái cây tự nhiên mà còn được tạo ra bởi vi sinh vật tự nhiên.
Có nhiều nơi người ta không bao giờ rửa nguyên liệu trước khi làm nát để tận dụng tối đa lượng vi sinh vật có trên vỏ. Họ dùng gần như 100% lượng nguyên liệu không cần rửa để lên men. Nhiều nơi khác họ chỉ lấy 1/2 hoặc 1/3 lượng nguyên liệu để sản xuất như một chất mang vi sinh vật tự nhiên vào quá trình lên men, còn 1/2 hay 2/3 khối lượng còn lại họ đem rửa sạch, làm nát cùng khố i lượng trên.
Tuy nhiên việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên để sản xuất rượu vang có nhược điểm là chất lượng sản phẩm thường không ổn định vì không kiểm soát được chất lượng giống ban đầu khi đưa vào để lên men, mặt khác rượu dễ bị tạp nhiễm do các giống men dại, vi khuẩn tạp nhiễm.
Do vậy, việc sử dụng giống vi sinh vật thuần khiết là điều cần thiết. Có rất nhiều loại nấm men tham gia vào quá trình lên men rượu.
3.4.2 Vi sinh vật thuần khiết trong sản xuất rượu vang
Giai đoạn quan trọng nhất trong quá trình sản xuất rượu vang là quá trình lên men. Quá trình lên men được chia làm hai giai đoạn: lên men chính và lên men phụ. Ở cả hai giai đoạn vi sinh vật đều đóng vai trò quan trọng, nhất là nấm men, nấm men tham gia trong quá trình chuyển hóa đường thành cồn. Trong sản xuất rượu vang, người ta sử dụng các chủng nấm men sau:
3.4.2.1 Saccharomyces vini
Saccharomyces vini còn gọi là Saccharomyces ellipsoideus (Lodder), phần nhiều là hình cầu, hoặc oval, có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như saccharose, glucose, galactose, maltose, fructose và 1/3 rafinose từ nhiều loại nguyên liệu khác như gạo, ngô, khoai sắn... Đối với acid hữu cơ, nấm men loại này có thể sử dụng bằng cách oxy hóa acid acetic và acid lactic, không sử dụng được acid succinic, acid malic, acid tatric và acid citric... Chúng có thể lên men lượng đường trong dịch lên men là 10 – 14 %, có khi là 16 – 18 %. Rượu tạo ra trong dịch lên men đạt 10 – 12. Nhiệt độ thích hợp là 28 -30. Saccharomyces vini rất phổ biến trong nước quả chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong dich lên men. Đa số chúng có hình oval có kích thước (3 – 8) x (5 – 12) m. Ở giai đoạn cuối quá trình lên men, S. vini dễ kết lắng và làm trong dịch quả. Ở giai đoạn này, chúng thường bị già, không chuyển đường thành cồn mà chết rất nhanh.
3.4.2.2 Saccharomyces oviformis
Có nhiệt độ lên men thích hợp từ 18 – 25C. Ở 35C, sinh sản bị ức chế, ở 40C sinh sản bị ngừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 16C sinh sản và lên men bị kéo dài. Giống thuần cũng có khả năng phát triển tốt trong môi trường nước nho và các loại quả khác, có khả năng chịu được cồn cao, đường cao, lên men cạn kiệt đường và tạo độ cồn 18. S. oviformis lên men được saccharose, glucose, maltosse, fructose và 1/3 rafinose nhưng không lên men được galactose và men nổi trên bề mặt dịch lên men tạo thành màng.
3.4.2.3 Saccharomyces uvarum
Được tách ra từ nước nho. Về hình thái S. urairum không khác với các loài khác nhưng khả năng sinh bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt cao hơn
nhiều so với các loài khác. Một số chủng của loại này có khả năng lên men đạt 12 - 13 cồn trong dịch nho lên men.
Tuy nhiên theo dõi quá trình lên men tự nhiên nhiều nơi, người ta nhận thấy rằng không chỉ có một giống nấm men hoạt động mà có nhiều giống phối hợp với nhau trong suốt quá trình lên men. Hệ nấm men trong quá trình lên men rượu vang hoạt động như sau:
Hệ nấm men trong giai đoạn đầu lên men nước nho là Kloeckera apiculata. Nấm men có dạng hình chùy chiếm ưu thế và hoạt động tích tụ được 2 – 6 cồn rồi ngưng hoạt động và chết dần. Sau đó, các nấm men rượu vang chủ yếu là Saccharomyces vini và Saccharomyces oviformis phát triển đóng vai trò chủ yếu trong quá trình lên men chính và lên men phụ. Trong các dịch quả khác, đặc biệt là nước táo thường thấy nấm men thuộc loài Schizosacchromyces acidodevoratus. Loài này phân hủy acid malic, làm giảm độ acid cho các dịch quả trong quá trình lên men. Vì vậy những nghiên cứu này đã gợi mở việc dùng nấm men thuần chủng để lên men nước quả nên phối hợp những chủng nấm men chịu được độ cồn cao để lên men tiếp theo. Như vậy mới lên men triệt để lượng đường có trong dịch lên men và cho rượu vang có độ cồn cao.
CHƢƠNG II
CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Phƣơng pháp đo độ đƣờng
1.1 Nguyên tắc
Khi đi từ môi trường (không khí) vào trong một môi trường khác (chất lỏng) tia sáng sẽ bị lệch (khúc xạ). Nếu chất lỏng là một dung dịch chất hòa tan (dung dịch đường, muối...), dựa trên độ lệch tia sáng, ta có thể tính được nồng độ của chất hòa tan. Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng chất rắn hòa tan.
Sử dụng Brix kế để đo chỉ tiêu này 1.2 Cấu tạo
Khúc xạ kế gồm chủ yếu một hệ thống lăng kính, kính quan sát và đọc, một thiết bị điều chỉnh nhiệt độ (chỉ số khúc xạ thay đổi rất nhanh với nhiệt độ). Phần lớn các khúc xạ kế đều đặt trên một đế hoặc trên một giá đỡ, một số loại cầm tay.
1.3 Phương pháp đo
Có thể sử dụng hydrometer (đo tỷ trọng của dung dịch ) hoặc refractometer (đo độ phản xạ của ánh sáng khi đi qua dung dịch) để đo chỉ tiêu này. Đơn giản nhất là dùng refractometer mặc dù vẫn có sự khác biệt về giá trị đo giữa hai dụng cụ.
1.3.1 Thiết bị và dụng cụ
Hydrometer và Refractometer (0 – 35 Brix).
Ống đong 250 ml.
Nhiệt kế.
Phễu lọc.
Beaker. 1.3.2 Hóa chất
Ít nhất là 300 ml mẫu (được lấy từ các vị trí khác nhau rồi trộn lại, đuổi hết CO2 ra khỏi mẫu).
Cồn 70% v/v (dùng để làm sạch và khô dụng cụ).
Dung dịch sucrose 20% (dung dịch chuẩn cho refractometer, tương đương 20Brix).
Giấy lau kính
1.3.3 Phương pháp tiến hành
Hydrometer
Cho mẫu (đã làm lạnh đến 20C) vào ống đong sạch và khô.
Đặt nhẹ nhàng hydrometer vào, không để cho hydrometer chạm vào thành và đáy của ống đong.
Để yên vài phút cho dụng cụ đo ổn định. Đọc kết quả.
Dùng nhiệt kế đo lại nhiệt độ của mẫu. Tính kết quả. Chú ý: làm sạch dụng cụ sau khi sử dụng.
Refeactometer
Làm sạch lăng kính bằng cồn 70o
trước khi sử dụng.
Lau khô bằng giấy lau kính.
Mỗi lần thay dung dịch kiểm tra, đều phải làm sạch và khô lăng kính.
Chỉnh refractometer vào vị trí có thể quan sát được tốt nhất.
Nhỏ nước cất vào lăng kính (tương đương 0Brix).
Nhỏ dung dịch sucrose vào lăng kính (tương đương 20Brix).
Nhỏ dung dịch cần đo vào lăng kính. Đọc kết quả.
Chú ý: không được để lẫn bọt khí vào dịch đo trong quá trình chỉnh dụng cụ và quá trình đo.
1.3.4 Đơn vị đo
Mỗi vùng sử dụng một đơn vị khác nhau để đo lượng đường. Đức, Áo, Thụy Sĩ dùng Oechslé. Pháp, Ý, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Úc, New Zealand dùng Baumé. Độ Brix (hoặc Balling) được sử dụng tại phần lớn các nước còn lại.
Cần chú ý rằng độ chính xác của phép đo phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ của mẫu chất lỏng. Do vậy cần chỉnh lý kết quả đo nếu nhiệt độ đo khác với 20C.
Lượng cồn tiềm tàng là lượng cồn có thể chuyển hóa từ lượng đường tương ứng có trong quả. Được tính theo khả năng chuyển hóa đường thành cồn: 16,83g đường/L tương đương với 1% alcohol.