- Gen PIF (P instability factor): PIF - like transposable elements là đoạn
ADN có khả năng di chuyển độc lập ngay trong nội bộ một thể nhiễm sắc hoặc từ thể nhiễm sắc này sang thể nhiễm sắc khác, còn gọi là gen nhảy (transposon).
Gen nhảy lần đầu tiên được Barbara McKlintock phát hiện và nghiên cứu ở cây ngô từ những năm 40 của thế kỷ XX, nhưng phải chờ đến những năm 70 – 80 với sự tiến bộ của kỹ thuật phân tích di truyền người ta mới hiểu rõ được cấu trúc và cơ chế hoạt động của transposon. Transposon được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và con người. Chúng rất đa dạng về độ lớn và cơ chế hoạt động, nhưng đều có điểm chung là được xếp xen kẽ vào hệ gen và sử dụng enzym transposaza để di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác của phân tử ADN. Nhiều nghiên cứu ở nhiều đối tượng khác nhau đã chứng minh rằng gen nhảy là cấu thành quan trọng của hệ gen và đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hóa của cấu trúc thể nhiễm sắc. Với khả năng di động di chuyển vị trí, các gen nhảy tạo nên sự tổ hợp lại hệ gen làm cho hệ gen càng đa dạng. Các gen nhảy có thể được xếp xen kẽ vào các đoạn exon, các đoạn intron hoặc vào vùng ADN điều chỉnh của gen và tạo nên các đột biến gen rất đa dạng [5, 18]. Trình tự amino acid vùng gen PIF khá bảo thủ trong cả các loài động vật và thực vật nên thường được dùng để thiết lập mối quan hệ tiến hóa giữa các loài [68]. Trong công bố mới đây nhất của Zhou và cộng sự (2010) [68] về việc so sánh 139 trình tự gen PIF tách từ 44 loài tre cho thấy PIF -
like transposase gen rất phổ biến, đa dạng và phong phú ở phân họ tre (Bambusoideae), nhưng lại tương đối bảo thủ ở mức độ loài.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài của luận văn được tiến hành tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 4/2011 đến tháng 8/2012.
2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu 2.2.1. Vật liệu
Gồm 19 mẫu lá của 3 loài tre thuộc chi Bambusa Schreb. cần làm sáng tỏ tên khoa học do biến đổi hình thái, đó là:
- Tám mẫu tre Bụng phật (3 mẫu dạng lóng phồng, 3 mẫu dạng lóng thẳng và 2 mẫu dạng lóng phồng và thẳng).
- Tám mẫu tre Đùi gà (2 mẫu dạng thân có lóng phồng, 3 mẫu dạng thân có lóng thẳng và 3 mẫu dạng thân có lóng thẳng toàn bụi).
- Ba mẫu tre Vàng sọc.
Các mẫu tre do Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cung cấp. Mẫu lá tươi sau khi thu được bảo quản trong silicagel và giữ ở nhiệt độ phòng hoặc bảo quản lâu dài ở -200C cho đến khi sử dụng. Danh sách và một số đặc điểm hình thái các mẫu có ký hiệu và nơi thu thập như trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguồn gốc và ký hiệu mẫu của 3 loài sử dụng trong nghiên cứu
Tên loài Tên khoa học
Ký hiệu mẫu
Địa điểm thu mẫu Một số đặc điểm hình thái Tre Bụng phật Bambusa vulgaris Schr.cv Wamin Mc Clure K3005/5 Chợ Đồn, Bắc
Kạn Cả thân khí sinh đều có lóng phồng (như Bụng phật). Bẹ mo 10- 13 cm x 10-13 cm x 8- 9 cm.
K3005/15 Tân Sơn, Hòa Bình K3005/16 Chí Linh, Hải Dương K3005/9 Châu Mộng, Phú Thọ Cả thân khí sinh các lóng đều thẳng. Bẹ mo dài hơn 15-20 cm. K3005/10 Chợ Đồn, Bắc Kạn K3005/12 Hà Nội K3005/13 Ba Vì Cả thân khí sinh có lóng phồng và thẳng. K3005/14 Ba Vì
Tre Vàng sọc Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland. cvVittata McClure K3011/3 Ba Vì, Hà Nội Lóng thẳng và tròn đều, vỏ thân có màu vàng tươi xen lẫn sọc xanh. Bẹ mo 22 cm x 15-17 cm x 8,3 cm. K3011/4 Chợ Đồn, Bắc Kạn K3011/8 Tuyên Quang, Chiêm Hóa Tre Đùi gà B. ventricosa McClure K3006/1 Thanh Ba, Phú Thọ Dạng thân khí sinh có lóng phồng đều (như đùi gà). Bẹ mo 17-19 cm x 7,8cm x 7,8 cm. K3006/2 Thanh Ba, Phú Thọ K3006/5 Thanh Ba, Phú Thọ Dạng thân có lóng phồng và thẳng trên cùng một thân. K3006/6 Chân Mộng, Phú Thọ K3006/7 Ba Vì, Hà Nội K3006/11 Quản Bạ, Hà Giang Dạng thân có lóng thẳng toàn bụi cây. Bẹ mo dài hơn 10-15 cm K3006/12 Văn Bàn, Lào Cai K3006/14 Đồng Hỷ, Thái Nguyên 2.2.2. Hóa chất
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: Các hóa chất tách chiết và tinh sạch ADN (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform,…); KIT tinh sạch genomic (fermentas); bộ hóa chất PCR (Fermentas), KIT tinh sạch sản phẩm PCR (QIAGEN Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Mỹ); hóa chất điện di agarose (agarose, đệm TAE…).
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong thí nghiệm: Máy PCR System
9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật Bản), bộ điện di Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức), máy ổn nhiệt (Memmert, Đức). Giải mã trình tự trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)…
Dụng cụ: Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf 2ml
2.2.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Cặp mồi nhân bản vùng psbA - trnHbao gồm: mồi psbA3'f do Sang và cộng sự thiết kế 1997 [57] và mồi trnH do Tate và cộng sự thiết kế năm 2003 [64]. Cặp mồi trnLF/trnFR nhân bản vùng trnL-trnF do Taberlet và cộng sự thiết kế năm 1991 [62]. Cặp mồi matK được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen
matK của loài Bambusa chungiicó mã HM448934 trên ngân hàng Genbank và cặp mồi PIF5/PIF3 do Zhou và cộng sự công bố năm 2010 [68]. Trình tự nucleotide, kích thước lý thuyết và nhiệt độ bắt mồi như trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thông tin của bốn cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Gen Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5’– 3’) Kích thƣớc lý thuyết (bp) Nhiệt độ bắt cặp (Tm)0C Ghi chú trnL- trnF trnLF/ trnFR CGAAATCGGTAGACGCTACG ATT TGAACTGGTGACACGAG 1000 55 Theo thiết kế của Taberlet et al. (1990) [62] psbA- trnH psbA3'f/ trnH GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 680 55 Mồi psbA3’f theo thiết kế của Sang et al. (1997) [57] Mồi trnH theo thiết kế của Tate et al. (2003) [64] matK matK19F/ matKR CGTTCTGACCATATTGCACTATG TACGAGCTAAAGTTCTAGC 1560 50 Thiết kế dựa trên trình tự của loài tre có mã HM448934 trên ngân hàng Genbank
PIF PIF5/PIF3 GGGGCTTTGGATGGAACACA ATGGCGAGGTTGAACAACTC 450 52 Theo thiết kế của Zhou at al. (2010) [68]
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số
ADN tổng số được tách chiết theo protocol CTAB của Doyle và Doyle (1987) [34]có cải tiến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Bảng 2.3. Pha đệm rửa (Washing buffer) ST T Tên hóa chất Nồng độ gốc Nồng độ làm việc Lƣợng pha 1. Sorbitol 182,17g 350mM 0,6375g 2. Tris-HCl 1M 100mM 1000µl 3. EDTA 0,5M 5mM 100µl 4. Sodium metabisulfit(NaH2PO4) 0,5% 0,05g 5. H2O Dẫn H2O đến 10ml
Bảng 2.4. Đệm tách chiết (Extration buffer)
STT Tên hóa chất Nồng độ gốc Nồng độ làm việc Lƣợng pha
1. NaCl 3M 1,5M 5000 µl 2. Tris-HCl 1M 100mM 1000 µl 3. EDTA 0,5M 20mM 400 µl 4. CTAB 4% 0,4g 5. H2O Dẫn H2O đến 10ml 2.3.2. Thiết kế cặp mồi
Trong nghiên cứu này, chỉ thiết kế 01 cặp mồi để nhân bản vùng gen matK. Để thiết kế được cặp mồi có tính đặc hiệu cao và giảm thiểu khả năng bắt cặp không đặc hiệu. Chúng tôi đã khai thác dữ liệu trong ngân hàng gen NCBI để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá cho matK đối với chi Bambusa Schreb. Sau đó sử dụng phần mềm Bioedit để so sánh, vùng bảo thủ nhất được sử dụng. Cặp mồi matK được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài Bambusa chungii
có mã HM448934 trên ngân hàng Genbank. Quá trình thiết kế được thực hiện trên phần mềm ADNstar.
2.3.3. Nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR
Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25µl với các thành phần: 13 µl H2O deion; 2,5 µl buffer 10X; 1 µl MgCl2 25mM; 2,5 µl dNTPs 2,5mM; 1,25 µl mồi xuôi (10 pmol); 1,25 µl mồi ngược (10 pmol); 0,5 µl Taq polymerase (5U/µl); 3 µl ADN
(10-20ng). Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ).
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94C trong 3 phút; tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: 94C trong 50 giây, 50 đến 55C trong 55 giây, 72C trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4C. Sau khi kết thúc phản ứng, 5µ sản phẩm PCR mỗi ống sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% cùng với thang ADN chuẩn 1kb. Gel agarose được nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới tia UV.
2.3.5. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình tự. Quá trình tinh sạch nhằm thu được sản phẩm đoạn gen mong muốn. Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ KIT QIAquick Gel Extraction của QIAGEN. Kiểm tra sản phẩm thu được trên gel agarose 0,9%.
2.3.6. Giải mã trình tự nucleotide các đoạn ADN
Trình tự nucleotide được xác định bằng kỹ thuật giải mã trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR theo hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) trên máy đọc trình tự ABI PRIMS® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen – Viện CNSH.
2.3.7. Phân tích số liệu
Các trình tự gen thu được được chỉnh sửa và phân tích bằng phần mềm chuyên dụng MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) version 4.0 [49], Bioedit, Clustal X, ADNstar,…vv. Trình tự ADN của 3 loài nghiên cứu được so sánh với các trình tự đã công bố trên Genbank tương ứng với 4 vùng gen nghiên cứu.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ các mẫu tre
Đã tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ 19 mẫu lá của 3 loài tre Bụng phật, tre Đùi gà và tre Vàng sọc với chất lượng ADN cao (hình 3.1) đủ tiêu chuẩn để thực hiện các bước tiếp theo . Kết quả đo OD cho thấy chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2. Điều đáng chú ý là trong quá trình tách chiết ADN từ các mẫu lá tre cần được nghiền mịn trong nitơ lỏng, ngoài chức năng làm dòn thành tế bào thì nhiệt độ thấp của nitơ lỏng còn kìm hãm hoạt động của các nuclease có trong tế bào. Nuclease là các enzyme phân cắt ADN, sự hoạt động của nuclease có thể làm giảm chất lượng ADN với sự xuất hiện nhiều đoạn đứt gẫy. Trong quy trình tách chiết ADN, cần làm sạch mẫu bằng việc bổ sung đệm rửa trước khi bổ sung đệm tách , bước này có thể loại bỏ phần lớn các chất bẩn có trong tế bào. Trong nghiên cứu này, để đảm bảo kết quả giải trình tự được chính xác chúng tôi tiến hành tinh sạch ADN tổng số bằng bộ KIT tinh sạch ADN (ADN Purification Kit).
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra ADN tổng số đại diện của một số mẫu tre trên gel
agarose 0,9% (Giếng 1 – 6: tre Bụng phật; giếng 7 - 9: tre Vàng sọc; giếng 10-15: tre Đùi gà)
3.2. Kết quả nhân bản trình tự ADN đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp lục lạp
Tất cả các trình tự ADN đích bao gồm gen PIF , gen matK, gen trnL-trnF, khoảng trống psbA - trnH thuộc hệ gen lục lạp đã được nhân bản thành công, các
sản phẩm PCR đều có kích thước đúng như lý thuyết dự đoán, đủ tiêu chuẩn để tiếp tục thực hiện các bước tiếp theo.
3.2.1. Kết quả nhân bản gen PIF
Trình tự ADN đích đã được nhân bản thành công với cặp mồi PIF5/PIF3 ở nhiệt độ gắn mồi là 52o
C cho 19 mẫu của ba loàitre Bụng phật (B. vulgaris Schr.cv
Wamin McClure) tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr. ex Wendland. cv Vittata
McClure) và tre Đùi gà (B. ventricosa McClure). Hình 3.2 là kết quả đại diện cho một số mẫu nghiên cứu của ba loài Bambusa, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 450 bp (đúng như kích thước lý thuyết dự đoán). Chất lượng của sản phẩm PCR được thể hiện khi điện di trên gel agarose 0,9% chỉ có một băng duy nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho tách đoạn gen nhân để giải mã trình tự.
Hình 3.2. Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi
PIF5/PIF3 điện di trên gel agarose 0,9%. (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng 3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb).
3.2.2. Kết quả nhân bản gen psbA-trnH
Cặp mồi psbA3’f/trnH đã được sử dụng để nhân bản đoạn ADN ở ba loài tre nghiên cứu . Theo lý thuyết, cặp mồi này sẽ nhân được đoạn gen có kích thước khoảng 680 bp. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR trên gel agarose 0,9 % thu được có kích thước khoảng 680 bp, kết quả này phù hợp với kích thước lý thuyết, sản phẩm chỉ cho một băng đặc hiệu và không xuất hiện các băng phụ (hình 3.3), đủ tiêu chuẩn để tiếp tục tinh sạch và giải mã trình tự nucleotide.
500 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
Hình 3.3. Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi
psbA3’f/trnH điện di trên gel agarose 0,9%. (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng 3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb).
3.2.3. Kết quả nhân bản gen matK
Sử dụng cặp mồi matK19F/matKR do chúng tôi thiết kế đã nhân bản thành công gen matK cho ba loài nghiên cứu (hình 3.4). Gen matK có kích thước đẩy đủ là 2450 bp, tuy nhiên trong nghiên cứu này cặp mồi được thiết kế cho nhân bản đoạn ADN chỉ có kích thước 1560 bp và nằm gần đầu 3’ của gen. Gen matK là một gen chức năng do vậy thường không có các đột biến thêm bớt nucleotide xảy ra trên gen, nên kích thước giữa các loài cũng tương đối ổn định. Sản phẩm PCR nhân bản gen matK có kích thước đúng như kích thước lý thuyết dự đoán. Kết quả nhân bản gen matK được thực hiện tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi là 500C.
Hình 3.4. Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi
matK19F/matKR điện di trên gel agarose 0,9%. (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng 3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 0.75 kb 0.5 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1.5 kb 1 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1.5 kb 1 kb
3.2.4. Kết quả nhân bản gen trnL - trnF
Phản ứng nhân bản vùng gen trnL-trnF được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu là 550C. Kết quả cho thấy, đã nhân được 1 phân đoạn đặc hiệu đúng với kích thước dự đoán, đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu giải mã trình tự ADN.
Hình 3.5. Sản phẩm PCR đại diện của một số mẫu tre phân tích với cặp mồi
trnL/trnF điện di trên gel agarose 0,9%. (giếng 1: K3005/5; giếng 2: K3005/9; giếng 3: K3005/13; giếng 4: K3011/3; giếng 5: K3011/4; giếng 6: K3011/8; giếng 7: K3006/1; giếng 8: K3006/2; giếng 9: K3006/6; giếng 10: K3006/11; M: marker phân tử 1 kb).
3.3. Kết quả giải trình tự 4 vùng gen nghiên cứu
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sử dụng làm ADN khuôn cho phản ứng PCR đọc trình tự. Quá trình xác định trình tự được thực hiện tại Viện CNSH trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Phản ứng đọc trình tự được thực hiện theo hai chiều bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp.
3.3.1. Kết quả giải trình tự gen PIF
Kết quả xác định trình tự vùng gen PIF nhân cho ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng (kết quả không chỉ ra ở đây). Các trình tự thu được của 19 mẫu nghiên cứu được sắp xếp theo hàng (alignment) bởi